在作为难治性疾病靶标的配体或抑制剂的小分子药物的开发中多样化的肽库是不可或缺的工具，通过噬菌体展示或mRNA展示等体外选择策略可以创建庞大的独特序列肽库，非天然氨基酸的掺入和环化策略的进步帮助科研工作者开发更多具有增强的治疗相关性的mRNA展示文库。虽然这些方法可靠地揭示了与选定细胞内靶标的高稳定性、高亲和力的结合剂，但是这些肽的细胞摄取能力无法得到保证。

在最近的一项工作中，来自俄亥俄州立大学的Dehua Pei教授课题组提出了一种新型的环状细胞穿透肽策略，这一类环状细胞穿透肽包含四个连续的精氨酸残基并与两个疏水残基（如苯丙氨酸或2-萘基丙氨酸）相邻并以“Head-to-tail”的方式环化（图2A），得益于环上残基的疏水能力和侧链结构的高度优化，细胞穿透肽的内体逃逸效率得到显著改善，但是由于C-termini参与到“Head-to-tail”的环化中，该方案与mRNA展示、噬菌体展示等策略不兼容。本工作中作者用侧链烷基化/环化（Side Chain Cyclization）策略取代了“Head-to-tail”的环化方法，新的策略使C-termini得到释放以便与各种展示技术兼容，同时侧链烷基化还允许在环的首尾相接处引入不同的连接基团以优化细胞渗透能力（图2B）。

作者将最初的环肽合成策略侧重于类似Pei课题组的“head-to-tail”环肽的四个相邻的精氨酸的肽序列：CFRRRRCG(1)，CWRRRRCG(2)的环化，他们首先筛选了九种不同的芳香族溴甲基连接组件（a-i）用于衔接环肽的头尾，通过流式细胞术分析MDA-MB 231细胞中每种肽的细胞内化情况，细胞摄取实验结果表明含色氨酸的环肽相较于含苯丙氨酸的环肽有更好的细胞摄取能力，用萘作为接头环化的肽总是比二甲苯类似物有更好的细胞摄取能力，此外在给定的芳香族连接组件中，烷基化位点也与渗透率之间存在相关性。综合来看，2h和2i作为新型环状细胞穿透肽的首尾连接组件具有全面的优势（图3）。此外，细胞摄取实验的结果还表明疏水氨基酸的增加可以增强环肽被细胞摄取的能力。

为了分辨细胞穿透肽是否具有内体逃逸能力，作者制备了环肽的羧基萘荧光素（NF）版本，基于NF荧光素在内体/溶酶体pH下几乎不发出荧光而在细胞质的pH下具有高度荧光这一性质，可以通过对荧光强度的监测实现对环肽内体逃逸能力的评估，实验结果表明2i^NF和4i^NF有统计学上相同的内体逃逸至细胞质的能力且显著高于其他的肽，此外每种肽的胞质进入都受到了血清的显著（图4）。

为了进一步提供新型环肽胞质递送的证据，作者将新型环状细胞穿透肽4i与癌细胞选择性细胞毒性肽PVKRRLFG（LFG）偶联，处理U2OS骨肉瘤细胞进行细胞杀伤实验，实验结果表明单独的LFG不具有细胞毒性，而在与环肽4i偶联后由于其具有优秀的细胞渗透能力和内体逃逸能力，因此毒性肽可以被递送至胞质并对癌细胞进行杀伤（图5）。

最后，作者对新型环肽4i与体外翻译的兼容性进行了评估，他们选取了先前在体外筛选实验中鉴定到的mRNA并在蛋氨酸替代物γ-叠氮高丙氨酸（Aha）和苯丙氨酸类似物对乙炔基苯丙氨酸（YnF）存在下进行体外翻译，在Ni-NTA上捕肽段后用2，3-双（溴甲基）萘和CuAAC进行顺序半胱氨酸烷基化成功使肽完全双环化，这表明这一新的策略可以良好适配mRNA展示或噬菌体展示的体外筛选方案。

总的来说，作者开发了一种新的环状细胞穿透肽4i，它具有高细胞摄取能力和内体逃逸能力，同时还可以将细胞不可渗透的细胞毒性肽从胞外递送至胞质，此外还具备噬菌体展示、mRNA展示等体外筛选技术高兼容性。这项工作所描述的新型环状细胞穿透肽为创建包含具有固有细胞通透性的肽的多种双环肽库打开了大门，并有望为困难靶标药物的发现提供新的线索来源。