■ 导读
殷文晶等对CRISPR/Cas9系统的发展历程和工作原理进行了详细介绍，系统综述了该技术在主要粮食作物及野生植物驯化中的应用情况，并对CRISPR/Cas9系统在未来农业中的发展和挑战提出展望。经过10年的快速发展，CRISPR/Cas系统已从最初的基因敲除工具，进化到碱基编辑和引导编辑，大大提高了靶点编辑的效率和可控性。相信未来会有更多靶向更精确、功能更齐全的基因编辑技术运用于作物育种改良。
标题
基于CRISPR-Cas9基因编辑技术在作物中的应用
作者
殷文晶，陈振概，黄佳慧，叶涵斐，芦涛，路梅，饶玉春
引用
殷文晶, 陈振概, 黄佳慧, 叶涵斐, 芦涛, 路梅, 饶玉春. 基于CRISPR-Cas9基因编辑技术在作物中的应用[J]. 生物工程学报, 2023, 39(2): 399-424.
摘要：CRISPR-Cas9系统是由成规律的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)及其相关蛋白构成，广泛存在于细菌和古细菌中，该系统作为一种特异性免疫保护，可抵御病毒、噬菌体的二次侵染。CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALENs)技术之后的第三代新型靶向基因组编辑技术。CRISPR-Cas9技术具有灵活、高效、生产成本低且特异性高等优点，极大地促进了基因功能方面的研究。CRISPR-Cas9技术经过不断的完善和发展，目前该技术已广泛应用在各个领域。本文介绍了CRISPR-Cas9技术的产生、工作机制及优势；综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、基因敲入、基因调控和基因组方面的应用以及在水稻、小麦、玉米、大豆和马铃薯等重要粮食作物以及对作物驯化的应用；分析了CRISPR-Cas9技术目前面临的问题和挑战，并展望了CRISPR-Cas9技术的发展及应用前景。
近年来，随着科学技术的不断完善和发展，基因编辑技术的问世掀起了基因工程的新浪潮[1]。基因编辑是一种能精准地对生物体基因组特定目标基因进行定点编辑和修饰加工的基因工程技术。该研究手段的出现，突破了以往研究材料难获得的限制，因其在动植物体内可以准确高效地进行定点基因组编辑，在基因功能研究、基因治疗、遗传改良等方面广泛应用，推动着生物学领域的发展。
基因编辑技术主要包括最先被应用在基因组定点编辑的锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)[2]、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALENs)[3]及具有简单高效易操作优点的成规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins, CRISPR-Cas)[4]技术。因前2项技术的DNA结合结构域组装复杂、改造成本高而未被广泛应用；而CRISPR-Cas具有设计简单、成本低、效率高等优点，在短短几年时间内，已被广泛应用在人类医学基因遗传疾病治疗、转基因技术研究和作物遗传育种改良等重要领域。
本文结合CRISPR-Cas9技术的部分研究结果，主要介绍CRISPR-Cas9技术的产生、发展、机制和CRISPR-Cas各种改造版本的应用，以及CRISPR-Cas9技术在作物驯化和育种中的应用成果，为开展基因编辑技术这一领域相关工作提供参考依据。
1 CRISPR-Cas9技术的简介
1.1 CRISPR-Cas9技术的产生、发展及机制
1987年，Ishino等[5]首次在大肠杆菌基因组中发现一段特殊的重复序列：由相似大小间隔序列所隔开的序列。2002年，Jansen等[6]在原核生物(细菌和古细菌)中发现了新的重复DNA序列并将其命名为聚集规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)，同时他们在CRISPR序列附近发现4个与CRISPR功能相关的Cas基因。2007年，Barrangou等[7]在原核生物中发现了一种由CRISPR序列和相关Cas基因介导调控，提供对抗噬菌体等外源基因的抗性，抗性特异性由间隔-噬菌体序列的相似性主导。2012年，Jinek等[8]进一步阐明了CRISPR-Cas系统的作用机制。基于获得性免疫系统，Church实验室对其进行优化和改造，设计并构建Ⅱ型CRISPR-Cas系统即CRISPR-Cas9系统(图1)，即在动植物细胞中由RNA引导的编辑工具并证明该系统在哺乳动物基因组可稳定、有效地应用[9]。与此同时，张锋实验室也设计了2种不同的Ⅱ型CRISPR-Cas系统，即短RNA可诱导Cas9核酸酶对人类和小鼠细胞内源性基因组位点进行精准切割，通过将多个引导序列编码到一个CRISPR阵列中，还可同时编辑哺乳动物基因组的多个位点[10]。Church和张锋实验室首次验证CRISPR-Cas系统在哺乳动物细胞基因组中的有效性。
2005年，Haft等[11]以Cas1蛋白进化树的分析及Cas基因操纵子序列信息等方面的差异，首次对CRISPR-Cas系统进行简单分类。2011年，Makarova等[12]以Cas1、Cas2基因为系统核心将多数CRISPR-Cas系统分为Ⅰ (含Cas3蛋白)、Ⅱ (含Cas9蛋白)、Ⅲ (含Cas10蛋白)型，少数无法分类的则命名为U型。2015年，Makarova等[13]对已知93个CRISPR-Cas系统的蛋白家族进行分析并建立位置特异性计分矩阵，整合多学科分类方法，定义出2种假定的新类型即隶属于“1”类和“2”类的Ⅳ和Ⅴ型CRISPR-Cas系统，已有的CRISPR-Cas系统分为5个类型、16个亚型(表1)[14]。目前，广泛应用于功能基因研究、动物育种领域的是“2”类CRISPR-Cas系统，即CRISPR-SpCas9基因编辑技术是基于化脓链球菌的获得性免疫系统，其具有设计简单、成本低、效率高、适用性广等优点，可实现基因敲除、敲入、定点编辑等[15]。
CRISPR-Cas9系统中的2个主要元件分别为向导RNA (small guide RNA, sgRNA)和Cas9蛋白。CRISPR-Cas9系统作用的靶基因中通常含有一段短的原间隔相邻基元(protospacer adjacent motif, PAM)，该段序列通常在靶DNA的3′末端作用。sgRNA是根据靶基因设计的一段小型非编码RNA，具有指导Cas9蛋白对靶基因进行定点编辑的功能。Cas9蛋白是一种核酸内切酶含有REC、RuvC、HNH和PI四个结构域，其中RuvC和HNH结构域具有切割活性，分别负责切割目的基因的靶标链和非靶标链，其切割位点在PAM序列上游的3–8 nt处，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的[16]。CRISPR-Cas9系统的机制是由sgRNA指导Cas9蛋白将双链DNA断裂(double strand break, DSB)引入特定的靶基因中，细胞中一旦发生这种断裂，就会引发同源重组修复(homology directed repair, HDR)或非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ) 2种自动修复机制(图2)，进而造成靶基因序列的插入、缺失和替换，从而实现基因组的定向改造[17-18]。
图1 CRISPR-Cas9系统的作用机制[9]
1.2 CRISPR-Cas9技术的优点
基因组编辑技术是新兴地、能精确地对生物体基因组目标靶基因进行特定修饰和定点改造及研究基因功能的一项技术。CRISPR-Cas9技术是继ZFNs和TALENs技术之后的第三代新型靶向基因组编辑技术。CRISPR-Cas9技术是CRISPR-Cas系统中应用最广泛的一种。
表1 CRISPR-Cas9系统的分类[14]
图2 双链DNA断裂的两种修复方式[19]
ZFNs和TALENs都是由特异的DNA结合结构域和非特异的切割结构域(核酸内切酶 Fok I)构成。CRISPR-Cas9同样也是由2部分构成，特异的sgRNA和非特异的核酸内切酶Cas9。在特异性和脱靶效应方面，CRISPR-Cas9强于ZFNs，但是较TALENs稍差；在设计和构建系统方面，ZFNs和TALENs都是通过特异的蛋白质序列对靶位点DNA进行识别，而CRISPR-Cas9则通过sgRNA识别特异序列，相对更好地设计及合成。因此，CRISPR-Cas9相较于ZFNs和TALENs更为简单；CRISPR-Cas9还具有制作成本低、不受甲基化限制、可同时对多个基因进行编辑等优势。除此之外，CRISPR-Cas9对于相同的靶点有相当好的靶向效率[18,20]。
2 CRISPR-Cas9技术的衍生技术
2.1 碱基编辑器
单碱基编辑器有2种，分别为2016年、2017年发展起来的技术胞嘧啶碱基器(cytosine base editors, CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)。CBEs系统的组成包括：具有单链切割活性的切口Cas9 (nicking Cas9, nCas9)蛋白、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor, UGI)；具体机制为：sgRNA引导nCas9蛋白对非靶标链进行切割，导致在靶基因编辑窗口中的胞嘧啶(cytosine, C)在胞嘧啶脱氨酶的催化作用下脱去一个氨基后突变为尿嘧啶(uracil, U)，UGI则阻止碱基U被切除的发生；在DNA复制过程中尿嘧啶U被识别为胸腺嘧啶(thymine, T)，随即与腺嘌呤(adenine, A)发生互补配对。在新一轮DNA复制时，腺嘌呤A与胸腺嘧啶T正常配对，进而实现C-T的转变。ABEs系统由腺嘌呤脱氨酶与具有单链切割活性的nCas9蛋白融合而成。具体机制为：sgRNA引导nCas9蛋白对非靶标链进行切割，导致在靶基因编辑窗口中的腺嘌呤A在腺嘌呤脱氨酶催化下脱去一个氨基变为次黄嘌呤(inosine, I)，在DNA复制过程中腺嘌呤A被识别为鸟嘌呤(guanine, G)，随即与胞嘧啶C发生互补配对，在新一轮DNA复制时，鸟嘌呤G与胞嘧啶C正常配对，最终实现A-G的转变[21-22]。
双碱基编辑器又称为饱和靶向内源基因突变编辑器(saturated targeted endogenous mutagenesis editor, STEME)，这种双碱基编辑器在sgRNA的引导下，同一靶位点编辑胞嘧啶和腺嘌呤时，C-T的突变效率高达61.61%，同时诱导靶位点发生C-T和A-G的突变，其效率高达15.1%，显著增加了靶基因碱基突变的效率饱和度及多样性[23]。
2.2 引导编辑器
2019年，Anzalone等[24]开发了一种编辑器-引导编辑器，该编辑器使用与逆转录酶融合后催化受损的Cas9蛋白直接将新的遗传信息转入到DNA靶位点，在人类细胞中应用次数超过175次，包括基因的靶向插入、缺失以及所有12种点突变的类型，引导编辑器无需双链的断裂和提供DNA供体模板。引导编辑器相较于碱基编辑器而言，具有互补的优势和劣势，该编辑器表现出比同源定向修复的效率相持平或更高且产生较少的副产物。其在已知Cas9脱靶位点上的脱靶效应比Cas9核酸内切酶低很多。这些优势的存在，大大扩展了基因组编辑的应用范围，理论上可纠正高达89%与已知人类疾病相关的遗传变异。
国内外许多研究学者还将引导编辑技术应用于作物改良中。Lin等[25]将引导编辑器应用在水稻和小麦中，成功进行了高达21.8%频率的点突变、插入和缺失编辑。Tang等[26]在水稻中针对性地开发了3个版本的植物引导编辑器，展示了其可用于精准编辑水稻内源基因的用途，并获得了最高为1.55%的编辑效率器。Xu等[27]开发的植物主要编辑器2系统在水稻转基因T0代时产生的突变频率高达31.3%。Butt等[28]利用引导编辑器编辑水稻中OsALS、OsIPA、OsTB1三个基因，最高编辑效率达2%并获得了一些优良性状的转基因株系。除水稻和小麦外，Lu等[29]还将引导编辑器应用于番茄基因组的编辑，最高编辑效率达1.66%，证明引导编辑器可对番茄进行编辑。Wang等[30]开发了更易于进行引导编辑的载体，同时验证了其应用于双子叶植物烟草、拟南芥和单子叶植物水稻中的有效性。
2.3 CRISPR-dCas9系统
Qi等[31]开发了一种基于Cas9控制基因表达的方法，当与sgRNA共表达时，Cas9会被催化而缺乏内切核酸酶活性，进而产生一种与DNA相关的识别复合物，该复合物特异性干扰转录、延伸、RNA聚合酶结合以及转录因子的结合，我们称之为CRISPR-dCas9系统。该系统在降低脱靶效应的同时可有效抑制大肠杆菌中靶基因的表达。这种由RNA引导的DNA识别，在全基因组范围内可选择性干扰基因的表达，可以同时抑制多个靶基因的表达，该作用是可逆的。在通用基因编辑方面具有很大的应用前景
CRISPR-dCas9系统通常在基因调控过程中发挥作用，即CRISPRi的转录抑制和转录激活作用。当dCas9 (nuclease-dead Cas9)与靶基因的开放阅读框结合时，能够阻止RNA聚合酶的延伸；当dCas9与靶基因的启动子或转录起始位点结合时，就会阻止基因转录的起始。早在2013年，Bikard等[32]靶向绿色荧光蛋白报告质粒的开放阅读框和启动子，设计了不同的crRNAs，均可诱导dCas9对绿色荧光蛋白的表达，导致该质粒在大肠杆菌中的表达强度降低，有效通过阻止RNA聚合酶的延伸发挥转录抑制作用。当dCas9与具有转录激活功能蛋白质的功能结构域结合时，可激活基因的转录。2013年，Maeder等[33]的研究发现，将dCas9蛋白与转录激活VP64融合后并在特异sgRNA的引导下，能显著激活人神经营养因子3基因和胚肾细胞HEK293血管内皮生长因子A基因的转录。
3 CRISPR-Cas9技术的应用
CRISPR-Cas9技术近几年发展迅速，在科研研究中的应用呈现多种形式，主要包括：基因敲除(单基因单位点敲除、单基因多位点敲除、多基因敲除)、基因敲入、基因调控和基因组等方面。在基因敲除方面的应用最为广泛，可同时靶向多个基因[34]。
3.1 CRISPR-Cas9技术在基因敲除中的应用
基因敲除在生命科学研究中是一项关键性技术，可以用来研究某个基因的功能并可以永久改变细胞表型，在医学临床遗传病的治疗方面具有良好的应用前景。CRISPR-Cas9技术的应用呈现多元化，传统的方法为构建敲除载体，主要通过农杆菌转化法将敲除载体转入植株中，经过1–2代培养后即可获得靶基因敲除的转基因株系[35]。基因敲除的靶基因可以是单个基因也可以是多个基因，对于靶基因而言，可以设计一个或多个sgRNA来定位不同的靶位点[36-37]。一般来说，研究者会针对同一个基因设计多个靶位点，以此来提高基因编辑的效率[38]。然而，获得多基因的共敲除突变体相对来说较为困难，但已有研究表明，多个sgRNA的串联对基因组编辑效率的影响并不大[39]。
3.1.1 单基因单位点敲除
蔡曼君[40]利用CRISPR-Cas9技术，以玉米籽粒发育基因Emp10为单靶基因构建单位点敲除载体，突变体株系的胚和胚乳出现发育停滞现象，籽粒成熟出现空瘪现象；研究者针对Emp10基因的作用机理进行分析后发现，当该基因缺失后，会影响植物细胞内线粒体电子传递链复合体I的活性及组装，氧化磷酸化途径受到阻碍，最终影响受精后ATP的合成导致籽粒发育不良。横向器官边界域(LBD)基因是植物特异性基因，在横向器官发育中发挥着重要作用。Liu等[41]通过CRISPR-Cas9技术敲除番茄中LBD基因家族的亚家族基因II中SlLBD40基因，该基因参与茉莉酸信号转导，敲除后的转基因株系增强了番茄的耐旱性。Feng等[42]以玉米中Zmzb7作为标记基因，利用CRISPR-Cas9技术构建体转化到玉米原生质体中进行突变，成功获得产生白化病表型的转基因株系。基于CRISPR-Cas9技术，将玉米的异染色质区域和常染色质区域的基因突变效率比较后发现，突变效率均在50%左右，这表明CRISPR-Cas9系统的基因靶向突变效率与染色质的存在状态并无关联。
3.1.2 单基因多位点敲除
刘玉琛等[43]针对番茄SlAP3的外显子上2个带有前间区序列附近的靶点Targ1和Targ2构建CRISPR-Cas9表达载体，序列对比分析发现SlAP3基因在PAM上游1–9 bp的碱基处均发生了缺失突变，导致SlAP3蛋白序列上的氨基酸缺失及翻译提前终止，从而获得番茄雄蕊同源异型不育株系。Cai等[44]利用CRISPR-Cas9特异性靶向诱导大豆光周期开花途径中的基因GmFT2a，针对该基因设计了3个靶向内源性位点，结果均发生蛋白翻译提前终止的移码突变，所有突变体株系开花周期均发生延长。大豆中存在拟南芥重要开花调控AtSPL3同源基因GmSPL3，吴艳等[45]构建了CRISPR-Cas9四突变位点的敲除载体，成功获得spl3abcd突变体，对比表型发现，在短日照环境下，spl3abcd突变体植株出现叶片变小、节数减少、节间距缩短、株高变矮等表型，这表明GmSPL3基因在调控大豆植株形态方面发挥重要作用。
3.1.3 多基因敲除
研究发现，通过利用CRISPR-Cas9多基因敲除系统，同时将多个基因作为靶基因，可获得多个优良性状共存的植株以及研究各个基因间相互作用的关系[46]。多个优良性状植株的出现为作物育种方面提供新的材料。
沈兰等[39]利用CRISPR-Cas9技术成功构建水稻中8个与农艺性状相关基因的共敲除载体，发现其中5个与产量(EP3、GS3、GW2、DEP1、Gn1a)相关的基因、2个与香味(BADH2)和光周期(Hd1)相关的基因、1个与株型(LPA1)相关的基因，此外还获得了纯合六突变株、七突变株、八突变株，为作物育种发展进程中快速引入遗传多样性提供策略。在油菜中，株高和分枝数是油菜植物重要的结构组成部分，直接影响油菜的产量。Zheng等[47]在油菜中通过CRISPR-Cas9靶向诱变敲除与拟南芥中MAX1 (调节株高及腋芽的生长)基因同源的2个BnaMAX1基因，突变效率高达56.30%–67.38%，获得分枝增加、株高半矮化的突变体株系，有助于增加每株的产量。有研究者利用CRISPR-Cas9技术对甘蓝型油菜中的2个分枝相关基因BnaBRC1和BnaBRC2进行定点突变，brc1突变体功能的缺失出现多分枝表型，由此进一步证明BnaBRC1基因参与了油菜的分枝调控[48]。TaQ基因的存在影响着小麦穗特征的发育。Liu等[49]采用CRISPR-SpCas9对小麦TaAQ、TaDq基因进行编辑，在T1代中得到了纯合植株，TaDq的敲除植株与野生型植株仅在株高上有差异，而TaAQ敲除植物或TaAQ和TaDq共敲除植物相比野生型和TaDq敲除植株更脆。
3.2 CRISPR-Cas9技术在基因敲入中的应用
CRISPR-Cas9技术在基因敲除方面的应用最为广泛，大部分用于实现对靶基因进行特异性敲除进而降低基因的表达量，但是许多优良性状的改良常常需要提高基因的表达量得以实现，因此，研究者借助基因定点敲高或敲入达到基因表达量提高的目的。
基因敲高是在目标靶基因的附近插入增强子或启动子等调控元件，进而提高基因的表达量。PPO1和HPPD是水稻中2种除草剂抗性基因，通过基因敲高除草剂相关抗性基因的表达可显著提高水稻对除草剂的抗性。但传统的转基因技术将目标靶基因整合到基因组时存在随机性。Lu等[50]则通过CRISPR-Cas9技术双靶位点进行编辑，靶位点分别是PPO1基因附近的CP12高表达基因及其启动子，HPPD基因附近的Ubiquitin2高表达基因及其启动子；2个靶位点则分别通过片段倒位使CP12基因启动子驱动PPO1基因高表达及片段重复使Ubiquitin2基因启动子驱动HPPD基因高表达，进而提高水稻对除草剂的抗性。
基因敲入是在基因组合适的位点插入目标基因，传统的基因敲入存在一定的随机性并可能会降低作物产量。而利用CRISPR-Cas9技术可实现在基因组安全港(genome safe harbor, GSH)发生定点基因插入，有效避免了新基因的插入对作物产量的影响。基因组安全港是基因组区域可以安全地容纳新基因，且不会导致细胞基因组发生其他可能对宿主细胞造成不利影响。Dong等[51]通过CRISPR-Cas9技术在水稻的2个基因组安全港靶向插入一个5.2 kb的类胡萝卜素生物合成盒，成功获得了种子中类胡萝卜素含量高且对形态或产量方面无检测损失的无标记水稻植株。
3.3 CRISPR-Cas9技术在基因调控中的应用
基因调控是生物体内控制基因表达的机制。基因调控发生在3个水平上，主要在DNA遗传水平上的调控发挥作用。CRISPR-Cas9成为基因组调控技术中灵活性较强的系统之一。
Cas9蛋白的剪切活性由Ruv C和HNH两个结构域决定，针对2个结构域的特征对Cas9蛋白进行基因突变修饰，促使Cas9蛋白核酸酶活性丧失但DNA序列识别功能保留，即dCas9，dCas9可与双链靶基因组结合，dCas9特性类似于调控基因表达的转录因子，因此，研究人员将dCas9与转录激活/抑制蛋白相结合，进而达到激活或抑制基因转录的目的[52]。dCas9单独存在时并不发挥作用[53]。虽然dCas9单独存在无法发挥作用，但它可以造成空间位阻现象，当dCas9结合在靶基因DNA序列的转录起始位点或启动子时，就可阻止转录起始的发生；当dCas9结合在靶基因的阅读框时，就可阻止RNA聚合酶的结合、转录因子结合及转录的延伸[54-55]。dCas9与不同的转录激活因子结构域融合后会生成转录激活或转录抑制因子，其作用于内源基因组来激活或抑制基因组靶标的转录，进而控制基因的表达[56]。
sgRNA引导dCas9的增加或减少来激活或抑制对基因组靶基因转录的调控，将sgRNA的靶点定位到启动子区域，可以更加高效地调控基因的表达[55]。转录激活结构域VP64与dCas9融合，与拟南芥启动子区CpG甲基化位点的C结合，促使CpG甲基化对AtFIS2基因转录的抑制作用得到解除[57-58]。Xing等[59]利用A3A-PBE剪辑编辑器对草莓FvebZIPs1.1高度保守的上游的初级开放阅读框(open reading frame, ORF)进行编辑，产生了7个新等位基因，提高了草莓的甜度。Zeng等[60]通过CRISPR-dCas9系统靶向控制淀粉合成基因Wxa的5′UTR内含子剪接位点进行转录后调控，获得不同淀粉含量的突变体，为培育高品质水稻提供了的新方向。
除此之外，CRISPR-Cas9也可在表观遗传水平上的染色质调控发挥作用，dCas9与DNA甲基化酶、乙酰化酶融合后对基因进行修饰，或通过改变启动子与增强子之间的相互作用的强弱来改变染色质的结构进而调控基因的表达[55,61]。
3.4 CRISPR-Cas9技术在基因组中的应用
CRISPR-Cas9技术现已成为一种有效的基因编辑方法，利用该技术诱导有针对性地染色体重排(交叉、倒位和易位)在作物育种领域中具有较大的潜力。Filler等[62]的研究证明CRISPR-Cas系统可通过诱导体细胞同源重组进行修复，进而实现靶向交叉。2019年，Schmidt等[63]在卵细胞特异性启动子的引导下，使用金黄色葡萄球菌的Cas9同源物在拟南芥中第一次成功诱导高达 18 kb的可遗传倒位。在后续研究中，他们同样使用之前的研究工具成功逆转了在拟南芥中1.17 Mb的染色体倒位[64]。
在最近研究中，Beying等[65]首次利用CRISPR-Cas技术靶向对拟南芥1号染色体和 2号染色体及1号染色体和5号染色体之间诱导发生相互易位。由RNA所引导的Cas9内切酶在特定靶基因序列处进行切割，会产生双链断裂的一种内在细胞的修复途径。而不精确地修复会导致染色体的插入、缺失或点突变。在果蝇中检测到Cas9介导的基因编辑通常会导致染色体臂的交换[66]。运用CRISPR-Cas9技术可实现染色体的大片段缺失，这为血液系统肿瘤发生、发展中的机制研究提供新的技术支持。程丽华等[67]利用CRISPR-Cas9技术成功构建了能使Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇发生缺失的慢病毒质粒载体，经PCR检测验证了该基因簇的片段缺失。工程化的CRISPR-Cas9是用于编辑真核生物基因组最有效且常用的工具，尤其在农作物中应用广泛。Li等[68]证明该系统应用在植物中会产生大片段染色体的缺失，可用于染色体片段的遗传分析、生物过程中基因功能的研究。
4 CRISPR-Cas9技术在作物育种中的应用
CRISPR-Cas9技术的应用具有高效、特异性和广谱性，所以备受研究者的关注和青睐，大量研究结果证实该技术适用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯等。其中，在水稻育种中的应用最为广泛(表2)。通常通过提高作物产量、改良作物品质、获得生物和非生物抗性、获得优良性状材料及驯化等方面对作物进行针对性改良。
4.1 在水稻中的应用
我国是世界上最大的水稻(Oryza sativa L.)生产国和消费国之一，“绿色革命”将我国水稻育种研究推向了一个更高的水平。如何突破传统的遗传育种技术，实现更加高效精确的分子育种是我国粮食安全以及农业可持续性发展面临的主要问题[120]。CRISPR-Cas9技术作为一种新型高效的基因组定点编辑技术，近年来在水稻作物育种改良方面备受研究者的青睐。
种子萌发率、分蘖数、每穗粒数及千粒重等都是决定水稻产量的关键指标，通过编辑相关基因达到提高水稻产量的目的。赤霉素(gibberellins, GA)是一种重要促生长植物激素，能解除种子休眠并刺激萌发，而DELLA蛋白在GA的信号通路中起抑制作用，SLR1基因编码DELLA蛋白。耿敏等[35]利用CRISPR-Cas9技术构建水稻OsSLR1敲除突变株，slr1相对于野生型日本晴在播种后提高了萌发率和生长速度。千粒重由籽粒中淀粉的合成和积累量及籽粒大小所决定，是典型的数量性状，水稻千粒重是预测产量的重要依据。TGW6基因编码吲哚-3-乙酸-葡萄糖水解酶，其等位基因功能的丧失通过对源器官多效性的影响导致水稻谷物重量的增加，进而提高水稻的产量[69]。王加峰等[70]对水稻TGW6基因的外显子进行靶向编辑，通过CRISPR-Cas9技术进行三位点突变，突变后植株的千粒重增加5%，为培育高产型水稻奠定基础。FWL2基因广泛存在于植物中且负调控细胞的分裂来控制器官和果实的大小[71]。王玲玲[72]采用CRISPR-Cas9技术针对水稻穗粒数调控基因OsFWL2构建敲除载体，在T1代分离获得无T-DNA插入的纯合突变体，培育出二次枝梗数、穗粒数和单株产量显著增加的株系，为水稻产量的提高提供了新的种质。
表2 CRISPR-Cas9技术在作物育种中的应用
通过编辑水稻稻米香味、控制直链淀粉和谷氨酸的相关合成基因的表达可以改善稻米的口感和品质。稻米中香味的主要成分是2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline, 2AP)，其合成前体4-氨基丁醛会被OsBADH2蛋白氧化后失去活性，其香味主要受一个隐性基因Badh2控制[73]。邵高能等[74]和祁永斌等[75]利用CRISPR-Cas9技术分别对中花11和常规品种中的OsBadh2进行编辑，均成功获得2-AP含量增加、香味性状明显改善的突变株系，为香味型水稻的育种提供新的种质资源。直链淀粉的含量是影响水稻食用品质的关键组成成分，水稻蜡质基因(Waxy, Wx)编码颗粒结合型淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase, GBSS)能直接控制稻米直链淀粉的合成[76]。冯璇等[77]利用CRISPR-Cas9技术对水稻优良保持系209B中的Wx位点进行定点编辑，获得了直链淀粉含量仅为1%的糯稻纯合保持系WX209B，纯合突变率高达26.9%，进而转育成糯稻不育系WX209A，证明了多靶点基因编辑技术能够提高纯合突变率且纯合突变体可以稳定遗传。谷物蛋白质含量(grain protein content, GPC)是谷物质量的重要决定性因素。利用CRISPR-Cas9技术靶向编辑氨基酸转运体基因OsAAP6、OsAAP10，结果发现在4个遗传背景不同的品种中，均可不同程度地导致谷氨酸蛋白含量的降低(T1代GPC下降2.9%–19.1%，T2代GPC下降1.5%–10.4%)，进而提高水稻品质[78-79]。
稻瘟病和白叶枯病严重限制了水稻的生长，也造成了水稻稻米产量的损失。CRISPR-Cas9通过对易感基因进行基因编辑获得抗病性水稻。OsERF922编码乙烯反应AP2/ERF转录因子，受稻瘟病菌的强烈诱导，对稻瘟病抗性起负调控作用[80]。Wang等[81]通过CRISPR-Cas9靶向突变水稻OsERF922基因在不影响主要农艺性状的前提下增强了水稻稻瘟病抗性，为水稻育种提供了新的种质资源。徐鹏等[82]利用CRISPR-Cas9技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因构建共编辑表达载体，成功获得了对稻瘟病抗性增强且稳定遗传的三突变纯合株系，在水稻育种方面具有较高的应用价值。水稻白叶枯病由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)所引起，是水稻生产中危害最严重的病害之一，能导致水稻高达50%产量的减少，增强水稻对Xoo的抗性是管理水稻白叶枯病的一种有效经济的方法。郝巍[83]利用CRISPR-Cas9技术对水稻白叶枯病感病相关基因HW3第一个外显子选定2个靶位点构建表达载体，成功获得抗白叶枯病植株，田间接种表型的调查结果显示，HW3基因突变产生的抗病表型能稳定遗传。Xoo的一个效应子通过转录激活水稻中Os-8N3 (Xa13)而引起白叶枯病。Os-8N3是TAL效应体诱导的易感基因之一，Os-8N3可以调节由Xoo引起在木质部导管中增殖和扩散的有毒铜重新分配，并使Xoo的生长易于获得营养物质进而引起疾病[84]。Kim等[85]利用CRISPR-Cas9技术靶向敲除水稻Os8N3基因，在不影响基本农艺性状的基础上得到了水稻对单胞菌pv抗性增强且花粉育性也未受到影响的突变株，这对水稻增强感病基因抗性具有现实意义。
非生物胁迫是水稻生长发育的主要因素之一，温度、干旱、杂草以及重金属等非生物胁迫都可能导致水稻大面积减产。CRISPR-Cas9技术是提高水稻的非生物胁迫抗性的有效方法之一。由于全球气候变暖，导致耕地干旱频率的发生不断增加，干旱已然成为影响水稻产量的重要非生物胁迫之一[86]。周天顺等[87]利用CRISPR-Cas9技术对AFP1进行敲除，结果突变体株系对ABA的敏感性和叶片水分散失率降低，而耐旱性、耐热性以及渗透胁迫能力增强。OsALS基因编码乙酰乳酸合酶，已有研究表明OsALS中特定氨基酸突变后可提高对乙酰乳酸合酶类咪唑啉酮除草剂(imidazolinone, IMI)的耐受性[88]。ALS基因的功能缺失性突变会致死，所以获得ALS突变的非功能缺失基因至关重要，Wang等[89]对CBE系统进行优化后大大提高了碱基编辑效率并扩大在水稻中的编辑范围，成功在ALS基因的第1882位的核苷酸实现了C-T的碱基替换，突变后的突变株表现出对IMI除草剂强的耐受性。Wang等[90]同样通过CRISPR-Cas9技术对OsALS进行突变，在第1882位的核苷酸发生C-T替换的同时形成一种新的水稻抗除草剂等位基因G628W，该基因的表达增加了水稻对除草剂的耐受能力。经后代鉴定和对表型调查显示，等位基因G628W的无转基因后代除株高降低外，其余性状与野生型植株并无差异。水稻是一种极易富镉的作物，过量镉的摄入会严重危害人类健康，OsNramp5基因编码一种镉和锰的转运蛋白，影响根中镉的吸收及分布，其功能的缺失极大地降低了根对镉的吸收和积累[91]。龙起樟等[92]构建OsNramp5基因CRISPR-Cas9敲除载体转基因株系，显著降低了镉的积累，在非镉污染环境下种植的4个品种OsNramp5基因敲除株系籽粒中镉含量均低于0.02 mg/kg，较野生型平均降低85.5%；而在镉污染土壤中种植时，不同品种OsNramp5敲除株系籽粒中镉含量均低于0.1 mg/kg，比野生型平均降低94.8%。
雄性不育系是传统杂交稻育种的核心，传统杂交育种具有周期长、劳动强度大等缺点，而利用CRISPR-Cas9技术敲除水稻生育相关基因，经过1–2代选育就可快速获得非转基因雄性不育系，加速水稻的育种[93]。Shen等[94]通过CRISPR-Cas9技术以两个籼稻品种9311和华占的雄性生育基因PTGMS2-1构建表达载体，成功获得光周期/热敏感基因雄性不育系水稻，温度是该突变体花粉生育力恢复的主要因素。Liu等[95]使用CRISPR-Cas9技术，在水稻中构建ZEP1基因敲除载体，产生了ZEP1的无效突变体，无效突变体表现出绝对的雄性不育但雌性育性正常，经遗传分析，发现在没有ZEP1的情况下，基因重组效率大大提高，遗传所产生的干扰完全消除，同时该突变体的产生为增加作物育种的遗传多样性提供了新方法。
4.2 在小麦中的应用
小麦属于异源六倍体，是世界上第二大粮食作物，为人类提供约20%的能量，由于其基因组较为庞大，育种也受到一定程度的影响。CRISPR-Cas9技术的高效性和特异性很好地解决了这一难题。研究人员对小麦通过CRISPR-Cas9技术定点突变，获得稳定遗传的优良性状突变体，这为CRISPR-Cas9技术在小麦育种方面的研究奠定基础[96]。与谷类粮食作物水稻类似，千粒重相关基因同样也影响小麦的产量，调控千粒重相关基因的表达对小麦的产量起着关键作用。Zhang等[97]通过与TaGASR7基因的3个同源物，基于CRISPR-Cas9技术对DNA或RNA介导的瞬时表达通过粒子轰击引入六倍体面包小麦和四倍体硬粒小麦的愈伤组织，在T0代获得千粒重显著增加的突变体。
过多谷蛋白的摄入会引起小肠损伤和炎症，易感人群还会出现营养不良、贫血、骨质疏松等并发症疾病，因此，在不影响产量的前提下有效降低小麦中谷蛋白的含量显得尤为重要。Sánchez-León等[98]利用CRISPR-Cas9技术通过以小麦谷蛋白免疫显性表位编码序列附近相邻的保守区域作为靶位点，精确有效地减少了小麦中谷蛋白的含量，获得了低谷蛋白、非转基因小麦。抗性淀粉是在健康人群小肠中一种不被吸收的淀粉，但抗性淀粉具有控制血糖、预防肠道疾病以及促进维生素和矿物质吸收等功能[99]。抗性淀粉的合成途径与直链淀粉的合成途径类似且存在显著的正相关关联，SBE是直链淀粉合成途径中的关键调控基因，通过抑制SBE基因的表达会使小麦中抗性淀粉的含量增加，通过介导CRISPR-Cas9技术构建水稻基因C-T单碱基基因编辑载体，对TaSBEIIa淀粉分支酶基因进行基因敲除，获得了高抗性淀粉含量的冬春小麦新种质资源[100]。
小麦白粉病是一种由真菌引起的病害，天气干燥时极易发生，严重时还会导致小麦产量大幅度减产。MLO (mildew resistance locus O)是植物特异性家族基因，mlo突变体对白粉病真菌具有有效且持久的广谱抗性。王延鹏等[96]利用CRISPR-Cas9技术对小麦白粉病易感基因MLO进行定向突变，成功创制出对白粉病具有广谱抗性的小麦品种，为小麦白粉病的抗病育种研究提供重要的初始材料。除此之外，EDR1基因已被证实对小麦白粉病具有调控作用，Zhang等[101]利用CRISPR-Cas9技术，同时修饰小麦EDR1 (enhanced disease resistance 1)基因的3个同源物获得了Taedr1小麦植株，通过对其进行病毒诱导或RNA干扰增强了小麦对白粉病的抗性，同时在Taedr1小麦植株中没有发现由于霉菌诱导而出现的细胞死亡，因此CRISPR-Cas9技术应用在抗逆性的研究育种中具有潜在的应用价值。
在杂交育种中，小麦的雄性不育基因及其突变体为杂交种子的生产提供宝贵的资源，雄性不育系可作为母本以此来提高后代种子的纯度，进而克服人工授粉的困难。小麦是异源六倍体，利用传统杂交方法获得核隐性雄性不育突变体相对困难，而CRISPR-Cas9技术可实现对多个同源等位基因同时突变，进而获得雄性不育突变体植株[102-103]。TaNP1基因在水稻和玉米中的同源基因分别为OsNP1基因和ZmIPE1基因，编码葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶，可调节绒毡层的退化和花粉外壁的形成。osnp1和zmipe1突变体均表现为完全雄性不育，Li等[102]利用CRISPR-Cas9技术，对TaNP1同源等位基因进行编辑修饰，获得TaNP1三重纯合突变导致完全雄性不育的突变小麦。
4.3 在玉米中的应用
玉米是禾本科植物，是仅次于水稻和小麦的第三大谷类作物，其种植面积广泛，相较于传统育种CRISPR-Cas9技术具有特异性强、育种周期短等优势，该技术的应用极大地推动了优良性状玉米品种的开发[104]。
CRISPR-Cas9技术主要用来提高玉米非生物胁迫抗性来提高玉米的品质。Svitashev等[105]针对玉米中一个编码乙酰乳酸合酶的基因ALS2，运用CRISPR-Cas9技术构建单链寡核苷酸或双链DNA载体作为修复模板成功获得耐氯磺隆的株系。耐旱性是衡量玉米产量的一个重要指标，Shi等[106]以玉米乙烯反应的负调节剂天然基因ARGOS8的启动子区域为靶点，通过CRISPR-Cas9技术将GOS2启动子替换ARGOS8的启动子或插入到ARGOS8基因的5′-非翻译区，获得了耐旱且产量提高的玉米品种。
随着生活水平的提升，人类对玉米的食用口感和品质的需求也不断提高，香味是作物的食味品质之一，基于CRISPR-Cas9技术对玉米香味负调控基因进行敲除可获得香味型玉米。BADH2基因编码甜菜碱醛脱氢酶，BADH2的突变会抑制香味物质2-AP的合成。张翔等[107]通过构建ZmBADH2-1和ZmBADH2-2香味基因的CRISPR-Cas9共敲除载体，成功创制出在玉米籽粒中就具有香米味道的玉米新品种。
雄性不育株系作为育种的重要材料，CRISPR-Cas9技术在培育雄性不育株系方面存在巨大的潜能。Svitashev等[108]基于CRISPR-Cas9技术在相同的4个基因组区域，针对玉米中liguleless-1 (LIG)、乙酰乳酸合酶(ALS2)以及2个雄性生育(MS26和MS45)基因，体外预组装纯化Cas9蛋白靶向转录gRNA，使用氢基因枪对玉米未成熟的胚胎细胞进行粒子轰击。通过与总基因组DNA传递实验比较后发现，轰击前后二者的突变频率、突变类型基本一致，而RNP传递的脱靶率以及纯合突变率显著降低。
4.4 在大豆中的应用
豆科植物种类繁多，大豆作为主要的豆科植物之一，是我国重要的粮食和油料作物，其营养价值丰富、生理活性强，也是人类植物蛋白质的主要来源，具有较高的营养和经济价值，用途极其广泛。同时，随着人类生活水平质量的不断提高，利用CRISPR-Cas9技术快速培育高产、优质的大豆品种具有现实性意义。
氮元素是植物生长发育的基本元素之一，保证植物正常摄入和利用氮元素，对农业的发展至关重要。根瘤作为根瘤菌与豆科植物的共生体，二者形成互利共生关系，其固氮量占豆科植物固氮量的77%，它可以转化大气中的氮气，进而为植物生长发育提供氮营养。因此，大豆的生物固氮作用也为农业生产的可持续发展提供重要保证。根瘤的存在为豆科植物的生长提供了丰富的氮元素营养，但由于生物固氮作用是非常耗能的过程，所以过多根瘤的存在会成为大豆生长的负担，因此控制根瘤的数目就显得尤为重要[109]。在豆科植物中提出一种负反馈调节机制-结瘤自主调控机制(autoregulation of nodulation, AON)，主要通过根-茎-根之间的长距离信号传导来实现对根瘤数量的控制。根据目的基因GmNARK设计3条sgRNA，构建CRISPR-Cas9敲除载体，获得具有超结瘤、叶片深绿、植株矮小表型的突变体，为研究大豆中结瘤固氮机制提供重要的遗传材料，同时提供新型大豆分子育种种质资源[110]。
通过CRISPR-Cas9技术构建大豆油酸、饱和脂肪酸、蛋白质等相关合成基因敲除载体，是获得优质大豆油的关键所在[111]。油酸是一种单不饱和omega-9脂肪酸，大量存在于动植物体内，具有降低有害胆固醇、缓解心血管疾病、防止脂肪硬化的作用。所以，培育高含量油酸的大豆对人体健康具有重要意义。12-脂肪酸去饱和酶2 (fatty acid desaturase 2, FAD2)是催化油酸形成亚油酸的关键酶，FAD2酶的存在会大大降低油酸的含量，因此，通过降低或抑制FAD2-1A基因的表达，可提高大豆种子中油酸/亚油酸 的比例。针对大豆油酸基因GmFAD2-1A，构建3个长20 bp的gRNA靶点的CRISPR-Cas9编辑载体并通过农杆菌介导的方法转入华夏3号大豆材料中，其突变体株系对种子中总蛋白和总脂肪的含量没有影响，但其种子中的油酸含量高达23%[112]。人类如果摄入过量的饱和脂肪酸，就会引起胆固醇的升高，增加脂肪硬化的风险。FATB蛋白是一种硫酯酶，具有释放酰基载体蛋白和游离脂肪酸的作用，其释放后的游离脂肪酸会参与脂肪酸链的合成与延长，Ma等[113]鉴定了一对大豆FATB编码基因GmFATB1a和GmFATB1b并通过CRISPR-Cas9技术对其进行敲除，敲除株系种子中棕榈酸和硬脂酸的含量显著降低，同时有益脂肪酸亚油酸的相对含量增加了1.3%–3.6%，为大豆在育种中提供优良的遗传材料。
大豆产量还受到非生物胁迫的影响，利用CRISPR-Cas9技术敲除大豆非生物胁迫相关敏感基因对大豆的生长和产量具有现实意义。蔗糖非发酵相关激酶(sucrose non-fermenting related protein kinases, SnRKs)是广泛存在于植物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，在植物的生长、发育、代谢和抗逆等方面发挥着不可替代的作用。GmSnRK1.1和GmSnRK1.2是SnRK1的2个主要表达同源基因，参与大豆多种抗逆途径的调控。利用CRISPR-Cas9技术构建GmSnRK1.1和GmSnRK1.2双基因敲除突变体，结果显示突变体植株降低了对ABA的敏感性及对碱胁迫的耐性[114]。
4.5 在马铃薯中的应用
马铃薯是我国乃至世界的重要粮食作物，具有较高的营养价值，因其淀粉含量极高，马铃薯是淀粉生产的重要原材料。马铃薯属于多倍体作物，现种植的多以四倍体为主，由于其遗传背景复杂、同源四倍体和高度杂合影响了种子的发育和育种。传统的育种方法周期长、可预见性低，无法满足现代需求。而利用现代育种手段CRISPR-Cas9技术可以有效地改善这一现状，加速马铃薯的育种进程[115]。
马铃薯中淀粉的含量及性质随直链淀粉与支链淀粉比例的变化而变化，因此，通过改变马铃薯中直链淀粉与支链淀粉的比例或使其仅含有一种淀粉将促进马铃薯的育种优势[116]。赵国超[117]在马铃薯中利用CRISPR-Cas9技术同时敲除马铃薯龙葵素合成关键基因甾醇侧链还原酶2基因(StSSR2)、在低温糖化中起关键作用的酸性液泡转化酶基因(VInv)以及直链淀粉合成相关的颗粒结合型淀粉合成酶基因(GBSS I)，获得了低龙葵素、抗低温糖化或支链淀粉含量高的马铃薯新品系。基因敲除马铃薯株系在表型、生理指标和块茎产量未产生明显的影响，适合农耕田间种植。Andersson等[118]将马铃薯颗粒结合淀粉合成酶基因GBSS作为靶标基因，利用CRISPR-Cas9技术构建靶向敲除载体，结果发现，GBSS酶活性的降低导致直链淀粉合成改变的淀粉和直链淀粉与支链淀粉的比例伴随增加。
马铃薯属于四倍体植物，四倍体的特性严重阻碍了马铃薯的育种进程。因此，研究人员尝试将自交亲和性引入二倍体种质，促使马铃薯的育种可以转变为二倍体自交或F1杂交品种育种的近交系。Enciso-Rodriguez等[119]利用CRISPR-Cas9技术靶向S-RNase基因的保守外显子区域，成功获得了稳定的自交性亲和的马铃薯二倍体株系，加快了马铃薯的育种进程。
4.6 在作物驯化中的应用
目前，在农业生产进程中，人们对粮食作物的培育主要集中在高产、稳产、营养、易栽培和抗逆等方面，这就使得主要栽培作物品种的资源和遗传多样性显得尤为匮乏，而部分野生作物天然具有良好的抗逆性和蕴含较高的营养价值便成为新作物选育的目标。但是，通过传统的育种方法来驯化野生作物需要耗费大量的时间和精力，无法适应当下快速发展的农业需求。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，对野生作物中多个有益基因进行同时编辑，大大加速了对野生作物的驯化进程。
Li等[121]使用CRISPR-Cas9技术对野生番茄从头驯化，获得了具有驯化表型但无Cas9后代株系且保留了野生番茄的抗病性和耐盐性。Zsögön等[122]基于CRISPR-Cas9技术设计了一种基因组工程策略，将理想性状与野生品种中天然的有用性状相结合，对6个位点进行编辑，使野生番茄从头驯化，最终得到果实大小增加3倍、果实数量增加10倍的优良株系。Zhu等[123]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对多倍体高杆野生稻的多种优良性状进行定向编辑改造，该技术在保留野生作物优良性状的同时大大加快了从头驯化的进程，同时也避免了传统驯化方法所需的长时间杂交和基因自然突变的选择。Yu等[124]通过利用CRISPR-Cas9技术对水稻“绿色革命”基因sd1编辑获得6个独立的突变体，其中粒长显著增加，另一方面也证明了该技术可直接促进野生异源四倍体水稻的改良。该项技术的开发加速了对野生作物的驯化。
5 CRISPR-Cas9技术目前面临的问题
5.1 技术问题
5.1.1 产生脱靶效应
CRISPR-Cas9技术依靠sgRNA的识别序列与靶向序列特异性结合发挥作用。其脱靶效应主要是由于基因组较复杂，sgRNA也会与基因组中非靶位点相似序列识别后匹配，导致脱靶效应的产生，这是主要原因之一。产生脱靶效应的另一原因是Cas9蛋白可能会识别非标准PAM。CRISPR-Cas9基因编辑系统理论上依靠Cas9对PAM位点上游3个碱基处进行切割。但在实际情况中，Cas9蛋白既能识别靶标位点附近的标准PAM (序列为NGG)，也能识别非标准PAM (序列为NAG)，研究者在设计靶向序列时常会忽略非标准PAM的存在，这也会在一定程度上引起该技术的脱靶[125]。
5.1.2 外源基因干扰
CRISPR-Cas9技术通常通过由农杆菌所介导的转化方式侵染植物以得到突变株系，当携带sgRNA和Cas9的编辑载体时，一些载体片段存在随机整合到植物基因组DNA，从而导致外源基因的引入。外源基因成分的存在会造成一系列无法预料和难以解决的生物安全问题[126]。像一些通过有性世代遗传分离的作物如水稻，研究者可在子代中筛选鉴定无外源基因成分的植株，但像马铃薯等一些不经有性世代遗传分离的作物，就无法避免外源基因成分残留的现象[127]。因此，通过将编辑载体的元件以核糖核蛋白的形式作为元件进行装载并应用到不经有性世代遗传分离的作物中去，从源头上切断外源基因的引入[109,128]。但此方法的操作难度较大，需要不断寻找合适的方法对其进行优化，以此提高效率适应更多作物的应用。
Liu等[129]开发了一种web应用工具：外源成分检测器(foreign element detector, FED)，基于全基因组测序数据来表明外源载体成分信息。它包括一个由26921个向量序列组成的向量序列库，可一次性完成对46695种不同外源元素序列的检测。由于其具有较高的灵敏度和准确性，FED可精确地检测出外源成分片段长度及所在基因组的位置，大大提高了对基因组编辑产品的检测效率。
5.2 监管问题
目前，由CRISPR-Cas9技术所引发的作物监管问题主要是CRISPR-Cas9技术在应用于作物时会引入外源基因成分，进而导致生物安全问题。CRISPR-Cas9技术是通过细胞自身的修复实现突变，与作物的自然突变、化学物理诱变非常相似，但实质尚未明确[130]。世界各国对CRISPR-Cas9基因编辑技术仍缺乏一致和明确的监管政策。2016年，美国农业部决定，不含外源DNA基因编辑的蘑菇和玉米不受传统转基因政策的监管，而欧盟将基因编辑作物归为转基因作物。我国于2001年颁布、2017年修订的《农业转基因生物安全管理条例》中第三条规定：“本条例所称的农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或农产品加工的动植物、微生物及其产品”。基因编辑技术是基因工程技术之一，所以按上述条例规定，基因编辑作物应当按转基因生物进行监督管理。但目前对于基因编辑作物的监管具体措施还未颁布。除此之外，一些中国学者对不含外源DNA的CRISPR-Cas9基因编辑作物的监管有争议，按传统的转基因生物进行监管会阻碍该技术的发展，因此，完善基因编辑作物相关监管政策有利于基因组编辑技术在作物育种中的应用[131]。
5.3 递送问题
CRISPR-Cas9基因编辑技术需借助递送系统进入到生物体内才能发挥编辑作用，如何将编辑元件高效地递送到生物体内将会直接影响编辑效率。目前最常用的传统递送系统主要有：生物学介导的递送(农杆菌、病毒作为介导)、非生物介质的递送、粒子轰击(基因枪)递送等方式，以及近些年发展起来的新型纳米技术递送系统[132]。
在植物遗传转化研究中最常用的递送工具是由生物学所介导，但由于其宿主范围受到限制，仅适用部分植物物种且还面临着如何高效地将外源基因整合到宿主基因组中的困难。粒子轰击常通过基因枪或借助外力递送到植物物种或细胞中，但该种方式的递送存在一定的局限性，经常由于不当的外力操作而导致植物物种组织受到损伤[133]。由于传统的递送系统具有宿主范围限制、外力不可控、效率低等缺点，因此，近年在研究领域中，纳米材料作为递送系统载体备受研究学者的青睐和关注。
目前，纳米材料作为遗传疾病、癌症治疗及靶向给药递送载体在医学领域广泛应用。基于不同的材料研究者们开发出了不同的纳米递送载体，主要包括二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticle, MSN)[134]、壳聚糖络合物单壁碳纳米管(carbon nanotube, CNT)[135]、分层双氢氧化物黏土纳米片(layered double hydroxide, LDH)[136]以及磁性纳米颗粒(magnetite nanoparticle, MN)[137]等。MSN作为递送载体将蛋白质通过生物学方法递送至植物细胞的选择基因或报告基因处，其可避免产生精准修饰的“非转基因植物”[134]。CNT在不借助生物学或化学的帮助下，有选择性地将质粒DNA递送到不同植物物种中的叶绿体中发挥边际作用[135]。无毒、可降解的LDH纳米片可促进dsRNA在烟草细胞中的递送[136]。载有磁性的纳米颗粒可将外源DNA在磁场的存在下递送至花粉中，通过磁化方式对花粉授粉，转基因作物也由此而来[137]。对于一些难以通过传统的生物学方法进行遗传转化的植物物种，纳米颗粒递送技术是一种有效的办法，解决了CRISPR-Cas9基因编辑技术的递送问题。
相较于传统的转基因递送方法，纳米颗粒技术的开发为基因编辑技术在各种作物中的递送提供了有利的基础条件。首先，纳米颗粒技术不再受到宿主的限制，根据材料的特性有选择性地高效地在植物物种细胞中进行递送，在实现高效递送的同时还能将生物分子有目标地递送到目标处发挥其编辑作用。
6 CRISPR-Cas9技术展望
自1987年以来研究者在大肠杆菌基因组中发现一段规律间隔特殊的重复序列，到2012年CRISPPR-Cas9技术作用机制被详细阐明，CRISPPR-Cas9技术的应用逐渐深入生物学领域。其作为一种带有特异性重复序列的核酸内切酶，经过研究者的不断开发和完善，在应用方面的高效性及广谱性已基本超越ZFNs和TALENs两种特异性核酸酶。
CRISPPR-Cas9技术的主要优势在于成本低、设计简单、特异性强、效率高，而且可对单个基因多位点或多个基因同时进行编辑。因此，CRISPPR-Cas9技术一经问世就得到生物界研究人员的广泛关注和青睐。除了传统基于DNA双链断裂的CRISPR-Cas9技术外，还存在基于单链断裂的碱基和引导编辑器，还有不会引起DNA断裂的CRISPR-dCas9技术。仅从2012到2022年这10年内，CRISPPR-Cas9技术经过不断地完善得到了飞速地发展。
目前，CRISPPR-Cas9技术成功运用于多种作物改良，尤其是在水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯等重要农作物中，该技术在提高作物产量、改良作物品质、获得生物和非生物抗性等方面都有广泛应用。传统依赖DNA双链断裂的CRISPR-Cas9技术对大部分性状改良明显。我们一方面应加强利用这些已创造出的优良品种在作物育种中的应用，推广农业种植，切实减轻农民负担；另一方面将CRISPR-Cas9技术巨大的应用潜能运用到更多的作物中，例如蓝莓、佛手、荔枝、金线莲、无花果等小的经济果树作物。不仅可以提高果树的产量、满足更大的经济市场需求，而且可以从外观、口感、营养价值等方面进行改良以满足人类对品质生活的要求。最重要的是提高作物的生物或非生物抗性，通过CRISPPR-Cas9技术培育同一作物的不同品种，以适应不同生长环境，减少运输成本，降低因地适宜的作物价格。
CRISPR-dCas9技术作为精准度较高的基因编辑和调控工作，具有较大的发展潜能。虽然该技术在水稻、拟南芥、烟草中已经得到应用，但存在效率低等问题，需要研究人员进一步完善和优化。
大量研究证明，基因编辑技术是快速准确地改善不同作物物种性状的可靠工具。2019年，Fernie等[138]在文章中讨论了就CRISPR-Cas9基因编辑技术在作物驯化应用方面对“再驯化”(re-domestication)和“重新驯化”(de novo domestication)的概念进行了重申，他们认为CRISPR-Cas9基因编辑技术加快了对作物的驯化，甚至实现了对作物进行从头驯化的可能。如今快速发展的现代生物技术和基因组学功能研究推动着基因编辑在作物中的应用，将基因编辑与作物育种相结合，有望掀起“第三次绿色革命”的浪潮。因此，我们应该从调查和收集更多野生优良种质资源，进一步加强作物代谢组学、基因组学、合成生物学等多重研究，挖掘并鉴定更多驯化基因，为作物的驯化提供更多的材料基础。进一步提高基因编辑技术的靶向效率、高效递送以及快速驯化，优化合成生物学并加强CRISPR-Cas9技术在作物中的应用，为作物的快速驯化提供一定的技术支持。
虽然CRISPR-Cas9技术面临脱靶效应、外源基因引入、生物安全问题等挑战，但我们相信，经过研究人员的不断完善和改进，这些挑战也终将会克服。针对CRISPR-Cas9技术所造成的脱靶效应，可以通过优化sgRNA和改造Cas蛋白来降低脱靶效应。针对CRISPR-Cas9技术引入外源基因这一问题，有研究发现可以通过其后代分离的方法去除外源基因的干扰；或通过将sgRNA和Cas9蛋白组装成核糖核蛋白复合体，从源头上避免外源基因。经过研究者的不断努力，我们相信会有更多更高效的基因编辑技术优化措施运用于作物改良。
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《生物工程学报》（1985年创刊，月刊）是由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办，国内外公开发行的学术期刊。本刊重点报道生物工程领域的最新研究成果与进展，主要栏目有：综述、工业生物技术、合成生物技术、环境生物技术、农业生物技术、食品生物技术、医药生物技术等。《生物工程学报》是北大中文核心期刊、中信所中国科技核心期刊、中国科学引文数据库CSCD核心期刊、中国科技期刊卓越行动计划入选期刊。本刊已被美国医学索引MEDLINE/PubMed、荷兰Scopus、美国化学文摘CA、美国生物学文摘BA、俄罗斯文摘AJ、日本科学技术社数据库JST、英国国际农业与生物科学研究文摘CABI、美国剑桥科学文摘（自然科学卷）CSA(NS)、波兰哥白尼索引IC、荷兰医学文摘EMBASE、中国科学引文数据库（CSCD）、中国知网（CNKI）、万方数据库等国内外多个检索数据库收录。《生物工程学报》曾获得百种中国杰出学术期刊(2012年)、中国精品科技期刊(2014−2017年)、中国科学院科学出版基金科技期刊排行榜三等奖(2015−2018年)等荣誉，并获得中国科协精品科技期刊学术质量提升项目(2015−2017年)、中国科协中文科技期刊精品建设计划“学术创新引领项目”(2018年)、中国科技期刊卓越行动计划项目（2019−2023年）资助。
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