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基因编辑技术与动物模型构建研讨会
2023年3月4-5日腾讯会议网络会议室
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type
II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。
目前，CRISPR/Cas9系统已经广泛用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。本学习班将详细讲解CRISPR/Cas9基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，将让大家详细了解到具体如何利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。
李博士，副研究员。2014年博士毕业于德国慕尼黑工业大学大型动物生物技术研究所, 获极优等荣誉学位（MAGNA CUM LAUDE）。主要研究领域为基因编辑动物模型构建与应用研究，成功构建过ROSA26基因定点敲入大动物模型、Kras基因点突变大动物模型、小鼠基因编辑肝癌模型等，在基因编辑研究领域积累了较好的研究知识背景，擅长对该领域知识讲解和传授，讲解深入浅出、逻辑性强，并可针对性对基因编辑实际操作问题进行解答与启发，以期更好地让基因编辑工具应用于您的工作和学习研究中。目前已发表论文22篇，其中第一作者/并列通讯作者SCI论文12篇，以第一发明人申请国家发明专利2项。主持完成国家自然科学基金等项目6项，获得上海市实验动物学会2020年度学会工作先进个人、2019年 “ICLAS-CALAS国际青年奖”、2018年第三十届上海市优秀发明选拔赛银奖、2017年上海市人才发展资金等。
【详细日程】
基因编辑技术与动物模型构建研讨会日程 | |||
日期 | 时间 | 主题 | 详细内容 |
第一天上午 | 9:00-10:30 | 基因修饰技术简介（一） | 基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍 |
基因编辑、基因修饰、基因打靶、转基因、基因敲除、基因敲入等专业领域概念梳理 | |||
CRISPR/Cas9结构和特点 | |||
如何使用CRISPR/Cas9系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤） | |||
拓展如何提高定点敲入效率等知识 | |||
10:30-10:45 | 休息 | ||
10:45-12:00 | 基因修饰技术简介（二） | 基因编辑工具Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的结构、特点、工作原理 | |
如何使用Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14系统进行编辑 | |||
Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14与Cas9的比较 | |||
Cas9、Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的应用和技术展望 | |||
上午现场答疑 | |||
12:00-13:30 | 午饭及午休 | ||
第一天下午 | 13:30-14:00 | CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍 | sgRNA设计方法和相关网站介绍 |
CRISPR（sgRNA）的在线设计（在线互动设计演练） | |||
14:00-15:30 | 基因编辑实验详细操作 | gRNA oligos模板退火 | |
退火gRNA与线性化CRISPR/Cas9载体连接 | |||
连接产物转化到大肠杆菌（DH5α），转化产物涂板培养，CRISPR/Cas9重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定阳性克隆 | |||
细胞转染（Electroperation，Nuclefection，Nanofection，X-fection）等介绍与应用拓展 | |||
单细胞克隆筛选（有限稀释法，滤纸法、环法、流式分选法等）方法介绍与应用拓展 | |||
15:30-15:45 | |||
15:45-17:00 | 利用CRISPR/Cas9技术编辑动物细胞系 | CRISPR/Cas9质粒细胞转染方法 | |
阳性细胞克隆筛选，基因修饰基因组DNA模板快速制备 | |||
目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物 | |||
PCR产物退火变性，T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况 | |||
17:00-17:30 | CRISPR/Cas9关键点总结、归纳、拓展 | 基因编辑关键知识点归纳、总结和提炼 | |
CRISPR/Cas9技术应用拓展（如CAB基因敲入方法等介绍） | |||
第二天上午 | 9:00-10:30 | 利用基因编辑技术构建基因敲除或敲入小鼠 | 基因工程小鼠的详细分类与比较 |
小鼠受精卵分离和培养 | |||
CRISPR/Cas9系统显微注射到小鼠受精卵 | |||
受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内 | |||
PCR和T7E1分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder） | |||
基因敲除小鼠基因敲除情况分析 | |||
CRISPR/Cas9构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结 | |||
10:30-10:45 | 休息 | ||
10:45-11:15 | 利用基因编辑技术构建大动物模型 | 以大动物猪为例，进行详细介绍基因编辑技术在大动物模型中的应用 | |
利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大型动物（猪）流程 | |||
基因修饰大型动物优势 | |||
利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪）模型介绍 | |||
11:15-12:00 | 利用基因编辑技术构建动物模型的详细案例介绍 | 利用CRISPR/Cas9构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型 | |
利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型 | |||
拓展基因编辑技术在其它物种中的应用 | 拓展基因编辑技术在其它物种中的应用 | ||
12:00-13:30 | 午饭及午休 | ||
第二天下午 | 13:30-15:00 | 实验结果的点评与讨论 | CRISPR/Cas9载体构建讨论 |
目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物结果讨论 | |||
PCR产物T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论 | |||
Sanger测序鉴定基因编辑结果：CRISPR/Cas9质粒阳性转化子测序结果确认；Sanger测序阅读基因编辑情况；如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型 | |||
15:00-15:30 | CRISPR/Cas9脱靶问题分析 | 脱靶产生的原因 | |
脱靶检测方法 | |||
降低脱靶问题的方法 | |||
15:30-15:45 | |||
15:45-16:30 | 基因编辑领域进展大梳理与全面拓展 | 基因编辑技术的应用拓展介绍：SHERLOCK-V1、SHERLOCK-V2等应用于检测方面的拓展，Base editing | |
结合当下新型冠状病毒热点，基因编辑工具用于检测新型冠状病毒、基因编辑工具有可能应用于新冠治疗等应用的介绍与拓展 | |||
Cas系列突变体的介绍与应用 | |||
基因编辑的拓展应用（如应用于杜氏营养肌不良综合征、白内障、消灭蚊子、植物中的应用、细菌中的应用等） | |||
基因编辑工具的伦理问题于讨论 | |||
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