作者：莱肯生物

很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。

然而，中国的专利年申请量已接近500万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。

本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。

今天让我们看看2023年第10周都公开了哪些农业生物技术相关的专利。

武汉大学申请的专利2021110371900（发明人：窦杨凡;耿涵;但志武;黄文超）提供了一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法。本发明方法为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因，能够克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性，使得籼粳稻亚种杂交的杂种优势在杂交水稻中的应用成为可能。

中国水稻研究所申请的专利2022113965197（发明人：唐绍清;胡培松;刘松;邵高能;魏祥进;焦桂爱;谢黎虹;圣忠华;胡时开;吴佳民;祝毛迪;操瑞节;陈雨娟）涉及一种水稻转录因子OsMYB73及其应用。正常野生型粳稻品种中花11成熟种子稻米胚乳表现为透明状，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻胚乳特异性表达转录因子OsMYB73，两个不同突变类型纯合突变体cr‑myb73‑35（插入C碱基）和cr‑myb73‑46（插入T碱基）稻米腹部胚乳呈现明显不透明垩白（腹白）性状，种子粒长和千粒重都极显著增加，直链淀粉含量升高，脂肪含量极显著降低，淀粉理化性质发生明显改变。本发明有助于阐明水稻粒形及粒重、胚乳淀粉生物合成和脂肪代谢的分子调控机理，为水稻产量及品质遗传改良提供新的重要基因储备、种质资源和理论基础，同时拓展水稻MYB结构域转录因子家族生物学功能。

三亚中国农业科学院国家南繁研究院和中国农业科学院作物科学研究所申请的专利2022115894641（发明人：周永力;李健敏）公开了水稻OsGLN7蛋白或调控其表达的物质在调控植物抗病性中的应用。水稻OsGLN7基因具有正向调控水稻抗白叶枯病的功能，通过使水稻OsGLN7基因过表达，能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性，经基因编辑后OsGLN7蛋白质功能缺失的植株抗病性降低。

中国水稻研究所申请的专利2022111348342（发明人：任德勇;钱前;张光恒;余海平;曾大力;朱丽;董国军;胡江;郭龙彪;高振宇;沈兰;张强;李清;胡敏）提供了水稻小穗发育基因LGS1、编码蛋白、重组载体、重组细胞及应用。本发明利用小穗异常突变体，通过图位克隆技术首先克隆到了LGS1基因，该基因编码一个表达蛋白，影响副护颖和护颖的特征，并基于此提出了副护颖、护颖和外稃是同源器官的假说，同时还通过影响颖壳的大小控制水稻籽粒大小。本发明实施例中还通过转基因互补实验，获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻。

山东农业大学申请的专利2022111812464（发明人：别晓敏;张宪省;肖军;李兴国;李梦璐;张春艳;刘雪美）公开了TaRF1基因及其编码的蛋白在提高小麦转化效率中的应用。利用TaRF1基因的CDS序列构建过表达载体，将TaRF1基因过表达载体导入农杆菌菌株，通过农杆菌介导法侵染小麦幼胚。结果发现，与对照载体相比，TaRF1基因过表达载体可促进核酸分子进入目的植物。利用TaRF1基因可以提高目的基因导入植物的转化效率，提高单子叶植物尤其是小麦的遗传转化效率。

济南大学申请的专利2022112939689（发明人：秦余香;张宝）涉及一种小麦耐盐基因TaSec14‑7B及应用。本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaSec14‑7B，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，超表达TaSec14‑7B后转基因植株的耐盐能力明显提高。

山东大学申请的专利2022115208083（发明人：白明义;吕金洋;樊敏;李根英;韩超）公开了一种利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用。通过设计靶向TaSK2A基因的单链引导RNA，构建敲除小麦体内TaSK2A基因的植物双元表达载体pBUE411‑TaSK2A；将该植物双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaSK2A基因敲除的转基因小麦，实现小麦种子籽粒长度的增加。实验证实TaSK2A基因敲除的转基因小麦实现了小麦种子籽粒长度的增加和千粒重的提高。

中国农业科学院作物科学研究所申请的专利2022117249302（发明人：曹双河;谢丽娜;张勇;夏先春;何中虎）公开了一种小麦储藏蛋白、淀粉和粒重调控基因TaB3‑2A1的分子标记及特异性引物和应用。本发明提供了检测小麦基因组中TaB3‑2A1基因的第523处SNP位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测小麦籽粒储藏蛋白含量和/或淀粉含量和/或千粒重中的应用；所述SNP位点为序列表的序列4所示DNA分子的第523位核苷酸。本发明的实验证明，TaB3‑2A1‑KASP523A/T分子标记与籽粒储藏蛋白含量、淀粉含量、粒重表型具有很好的相关性，能够作为籽粒储藏蛋白含量、淀粉含量和粒重表型的分子标记，用于辅助小麦种质的改良。

河南科技大学和洛阳农林科学院申请的专利2022110977205（发明人：赵德辉;杨莉;王春平;张伟;刘瑞芳;曾占奎;闫雪芳）涉及与小麦千粒重基因QTL紧密连锁的分子标记及其应用。所述QTL位于小麦1A染色体，命名为QTGW.haust‑1A，与其紧密连锁的KASP标记为KaspAX‑108927771，这标记可用于QTGW.haust‑1A辅助选择。

江苏大学申请的专利2022116256116（发明人：何华纲;魏巧;陈昭昭;张倩渊;朱姗颖）涉及一种小麦抗白粉病基因Pm68特异性分子标记及其用途。本发明所提供的分子标记记为Pm68‑M1，其PCR扩增特异性产物大小为156 bp。本发明的分子标记Pm68‑M1具有稳定扩增的多态性条带、重复性好、分辨率高等优点，且在不含有Pm68基因的小麦材料中没有非特异性扩增产物，本发明公布的分子标记Pm68‑M1在小麦抗白粉病基因Pm68的转育中具有重要的实用价值。

中国农业科学院蔬菜花卉研究所申请的专利2022109041073（发明人：张圣平;顾兴芳;苗晗;戴卓男;董邵云;刘小萍）公开了一种用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的SNP分子标记及其应用，所述SNP标记的位点为黄瓜6号染色体物理位置第27,919,339bp处，该位点的碱基是A或T，该位点碱基为A的黄瓜材料为感灰霉病黄瓜材料，该位点碱基为T的黄瓜材料为抗灰霉病黄瓜材料。

石河子大学申请的专利2022110102398（发明人：薛飞;王学峰;梁倩;邵冬南;孙杰;杨永林）涉及一种鉴定陆地棉红叶矮杆性状的分子标记及方法和应用，所述InDel分子标记为棉花第A09染色体上第79598917位碱基的基因型为ACT或A。本发明开发了鉴别陆地棉红叶矮杆性状的InDel分子标记。在陆地棉矮红株与新陆早74构建的F2群体中的红叶及株高表型变异均可用该InDel分子标记鉴别。同时，该InDel标记可用于陆地棉红叶矮杆性状的分子标记辅助选择。

中国热带农业科学院南亚热带作物研究所申请的专利2022112862795（发明人：柳凤;周思思;卢乃会;姚全胜;詹儒林）提供了芒果细菌性角斑病抗性基因的KASP标记及其应用。该KASP标记位于芒果15号染色体第1,299,510位碱基，碱基多态性为G/A。本发明提供的KASP标记与芒果的细菌性角斑病抗性表现显著相关，与表型吻合度高、鉴定准确率高，可用于抗细菌性角斑病的芒果品种快速筛选和育种中。

广东省农业科学院蔬菜研究所申请的专利202211509153X（发明人：李涛;宫超;李植良;孙保娟;黎振兴;游倩;衡周）涉及一种茄子抗青枯病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记为SNP910，且核苷酸多态性为C/A。本发明首次公开了控制茄子抗青枯病性状的基因座位及与其紧密连锁的SNP分子标记，该分子标记能够准确、快速地鉴别出抗青枯病茄子品种和个体，可用于茄子抗青枯病种质资源的预测和筛选，也可以用于分子辅助育种创制抗青枯病茄子品种。

河南农业大学申请的专利2022114209695（发明人：杨路明;豆峻岭;朱忠厚;杨森;朱华玉;牛欢欢;王银萍）公开了两对与西瓜果皮间歇性条纹基因ClIS紧密连锁的分子标记及应用。本发明首次对西瓜果皮间歇性条纹性状进行了精细定位，获得了两对与间歇性条纹性状紧密连锁且扩增稳定、多态性好的Indel标记。这两对Indel标记与西瓜果皮间歇性条纹基因ClIS紧密连锁，可用于西瓜间歇性条纹性状的分子标记辅助育种。

上海科技大学申请的专利2020801015031（发明人：季泉江;吴兆韡;张翼飞;王玉珏;王艳男）涉及一种基因组编辑系统及方法。

本发明提供基于Cas12f核酸酶的基因编辑系统，该系统可以将细胞内的目标基因精准敲除；体外切割实验中，能将目标基因精准切断。

中国农业科学院油料作物研究所申请的专利2022105394485（发明人：陈李淼;曹东;陈海峰;周新安;郭葳;杨红丽;郝青南;单志慧;陈水莲;张婵娟;袁松丽;杨中路;黄毅）公开了一种与植物耐盐性和/或孢囊线虫抗性相关的GmMYB14蛋白质及其相关生物材料与应用。

本发明通过克隆大豆GmMYB14基因，构建由CaMV35S启动子驱动目标基因GmMYB14的双元表达载体，转化大豆，获得转GmMYB14大豆植株。通过对野生型和转GmMYB14大豆植株的功能分析发现，与野生型相比，转GmMYB14大豆植株的耐盐性和抗孢囊线虫作用明显增加。说明GmMYB14基因是提高植物抗逆性和抗虫性的重要候选基因，具有潜在的育种价值。

中国农业科学院作物科学研究所申请的专利2022110435381（发明人：杜雪梅;王国英;王建华;徐卓伊;顾日良;付俊杰）涉及一种控制玉米花期和穗上叶数的基因Lfy1及其应用。本发明所提供的基因在玉米中编码AAA ATP酶，本发明还公开了在所述基因上游26 kb处存在一个copia类型的LTR转座子，可增强Lfy1基因表达。本发明还提供了五个InDel标记和一个SNP标记，所述InDel和SNP标记在遗传群体中与Lfy1基因紧密连锁，可用于分子标记辅助育种。本发明所提供的Lfy1基因可用于玉米生育期、叶片数、生物量的改良中，具有重大的应用价值。

中国热带农业科学院热带生物技术研究所;中国热带农业科学院三亚研究院申请的专利2022112862530（发明人：付莉莉;铁韦韦;丁泽红;胡伟;张家明）公开了一种调控木薯块根内皮颜色的基因MeMYB4及其应用。本发明准确鉴定了MeMYB4在调控木薯块根内皮颜色的功能，为提高木薯块根花青素含量、改良木薯块根外观和营养品质提供了理论依据和关键基因。

四川农业大学申请的专利2022114935220（发明人：罗娅;王良新;侯国艳;刘晓阳;蒋语嫣;杨敏;彭玉婷;汤浩茹;张勇;陈清;李梦瑶;林源秀;张云婷;刘泽静;胡剑峰）公开了一种调控草莓叶色的FaPDS基因及其应用。本发明提供调控草莓叶片颜色相关基因FaPDS，并通过构建FaPDS基因敲除的植物表达载体，经农杆菌介导法转化‘红颜’草莓的叶圆片，获得的FaPDS基因编辑植株叶片表现出紫红、黄红、白红、绿红等不同的颜色。

中国农业科学院生物技术研究所申请的专利2022114621242（发明人：林敏;王劲;燕永亮;桂元;周正富;战嵛华;柯秀彬）和2022114622851（发明人：林敏;王劲;周正富;燕永亮）涉及一种新型糖苷水解酶DogH基因和耐辐射异常球菌dodH基因及其提高生物抗逆性的方法。

四川大学申请的专利2018105810910《一种转NtZFP8基因提高水稻组织培养分化效率的方法》（发明人：徐莺;时小东;顾雨熹;陈放;王灵慧;吴艳）经实质审查后于2020年01月08日以申请不符合专利法第22条第3款的规定为由被驳回。申请人于2020年04月23日向专利复审委员会提出了复审请求。合议组经过审查，做出了维持原驳回决定的审查决定。今天，就让我们详细看看这个专利。

本发明提供的一种转NtZFP8基因提高水稻组织培养再生率的方法，经试验验证NtZFP8基因能够促进水稻外植体和愈伤组织分化，分化得到的再生芽能够发育成植株，因此可将所述基因和重组质粒应用于品种选育和组织培养工厂化生产。

国家知识产权局原审查部门于2020年01月08日以权利要求不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所针对的权利要求如下：

“1.一种愈伤分化效率高的水稻品种的培育方法，其特征在于，由下列步骤组成：

1）将序列如SEQ ID NO. 1所示的DNA片段构建到pCAMBIA1301载体上，得重组子；

2）将重组子转化到感受态农杆菌EHA105内，得重组农杆菌；

3）将重组农杆菌悬浮于含有乙酰丁香酮的AAM培养基中，加入水稻愈伤组织进行共培养，3天后取出；

4）将愈伤放入含有50 mg/L潮霉素的N6D培养基筛选2次，得抗性愈伤；

5）使抗性愈伤分化成苗，即得到愈伤组织分化效率高的水稻品种。”

驳回理由为：权利要求1请求保护一种愈伤分化效率高的水稻品种的培育方法。对比文件1（CN106801062A）公开了愈伤组织的分化效率高的植物的培养方法，包括将SEQ ID NO.1所示的基因片段构建成重组pCAMBIA1301载体，进而构建成重组农杆菌EHA105，从而将其用于转化植物，获得愈伤组织分化效率高的植物。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：（1）植物为水稻；（2）限定了共培养基为含有AS的，筛选培养基为50 mg/L潮霉素的N6D，并限定了共培养天数和筛选次数。权利要求1实际解决的技术问题为：如何将该方法应用于水稻。然而，（1）水稻和烟草均属于本领域常规使用的模式植物。有动机采用常规实验手段将其转用于提高水稻外植体和/或愈伤组织的分化效率。（2）培养基是常规使用的农杆菌感染愈伤组织的培养基，N6D培养基是常规使用的水稻愈伤培养基，50 mg/L潮霉素是常规的抗生素，共培养天数和筛选次数也是实验常规的条件。因此权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。

申请人四川大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2020年04月23日向国家知识产权局提出了复审请求。

复审请求人认为：（1）人们尝试了各种办法，水稻分化率始终无法达到100%。文献1（Hu H，Yang L X. Rice SERKI gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection[J].Planta，2005，222（1）：107-117.）摘要报道，过表达SERKI只能将愈伤分化率从72%提升到86%，提升幅度十分有限。（2）植物再生的两种方式参考文献2（孙贝贝等，植物再生的研究进展，科学通报，2016，61（36）：3887-3902）。水稻的再生方式是体细胞胚发生（文献3：王大元，禾谷类植物的细胞培养和体细胞胚胎发生，细胞生物学杂志，1984年），烟草的再生方式是器官从头发生（文献2），因此，不能因为NtZFP8这个来自于烟草的基因能够提高烟草愈伤分化效率，推知NtZFP8可以提高水稻愈伤分化效率。烟草容易达到100%分化率（文献4：陈辉等，烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证，安徽农业科学，2009，37（14）：6333-6334;文献5：詹虹等，烟草叶片再生芽器官组织培养研究，宁夏农林科技，2012，53(12）：81-83），而水稻很难。因此NtZFP8是否能显著提高水稻愈伤分化效率，是否能提高到100%，这是无法通过因果关系推导得出的。

经形式审查合格，国家知识产权局于2020年04月28日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。

随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。

合议组于2022年06月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：

对比文件1公开了提高烟草愈伤组织培养分化效率的方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）用于水稻品种；（2）限定了共培养培养基为含有乙酰丁香酮的AAM，筛选培养基为50 mg/L潮霉素的N6D，并限定共培养天数和筛选次数。权利要求1实际解决的技术问题是：如何培育愈伤分化效率高的水稻品种。

然而，（1）对比文件1还记载了NtZFP8基因转入植物中，提高植物外植体和愈伤组织分化效率的构思（参见对比文件1），并且提到了水稻愈伤组织分化效率的问题（参见对比文件1）。即对比文件1暗示了NtZFP8基因可转入其他植物如水稻中以解决愈伤组织分化效率的技术问题。本领域技术人员有动机将NtZFP8基因转入水稻中，并预期对水稻愈伤分化效率的提高。（2）悬浮农杆菌感染愈伤组织培养基为添加终浓度200 μmol/L AS的培养基，N6D是常规的水稻愈伤诱导（继代）培养基，潮霉素是转基因水稻中常规使用的筛选标记（公知1：刘向东，李亚娟主编，植物生殖生物学研究法[M].广州：华南理工大学出版社），水稻的转基因和愈伤组织的培养是本领域技术人员熟知的，潮霉素浓度、共培养天数和筛选次数都是通过常规调整即可得到的。因此权利要求1不符合专利法第22条第3款规定的创造性。

关于复审请求意见，合议组认为：

（1）现有技术中（如文献1）的各种办法不能使水稻愈伤分化效率提高到100%，并不意味着本领域技术人员无法获得本申请的技术方案。愈伤组织的分化效率的具体数值与多种因素相关。此外，3株转基因水稻的实际样本基数是多少并不清楚，100%的分化率不一定具有统让学意义。

（2）器官从头发生和体细胞胚发生代表了不同类型的外植体来源，其本质都是在伤口或胁迫信号指导下的细胞命运转变（参见文献2）。胚性愈伤组织（如水稻体细胞胚发生）比非胚性愈伤组织（如烟草器官从头发生）的再生过程多了体细胞脱分化为胚胎细胞从而获得多能性的过程，但是形成的愈伤组织都具有干细胞的多能性，可以再分化成植物组织。在无明显反向教导证据的前提下，本领域技术人员会倾向于预期SEQ ID NO.1能够提高水稻分化效率。

复审请求人于2022年08月15日提交了意见陈述书，并根据说明书实施例2的内容，在权利要求1中补充了步骤6）。新修改的权利要求1如下：

“一种制备分化效率高的水稻愈伤组织的方法，其特征在于，由下列步骤组成：

1）将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段构建到pCAMBIA1301载体上，得重组子；

2）将重组子转化到感受态农杆菌EHA105内，得重组农杆菌；

3）将重组农杆菌悬浮于含有乙酰丁香酮的AAM培养基中，加入水稻愈伤组织进行共培养，3天后取出；

4）将愈伤放入含有50 mg/L潮霉素的N6D培养基筛选2次，得抗性愈伤；

5）使抗性愈伤分化成苗，即得到愈伤组织分化效率高的水稻品种；

6）将所得水稻品种按照如下方法制备愈伤组织：

1）水稻种子消毒：

70%酒精30 s，6%次氯酸钠15 min，蒸馏水清洗5次。

2）愈伤诱导及分化：

种子平铺放置于N6D培养基上，生长10天后将愈伤组织切下放入MSNK培养基上培养3-4周；

所述N6D培养基按照如下方法制备：取3.98g N6盐混合物、10 mL N6-vitamin、0.l g肌醇、0.3 g酪氨酸、2.878 g脯氨酸、5mL 200X 2,4-D、30 g蔗糖、3g gellan，加水至总体积1 L，调pH为5.8；

所述MSNK按照如下方法制备：取4.6g MS、10 mL MS-vitamin、0.1 g肌醇、2 g酪氨酸、1mL 1000 NAA、20 mL 50 KT、30 g蔗糖、30 g山梨醇、3g gellan，加水至总体积1 L，调pH为5.8。”

复审请求人认为：（1）修改后的权利要求1的技术方案就是实施例2的技术方案，可以达到实施例2结果所示的100%愈伤分化效率的效果。（2）人们尝试了各种办法，水稻分化率始终无法达到100%。文献1报道，过表达SERKI只能将愈伤分化率从72%提升到86%，提升幅度十分有限。这表明本申请取得了预料不到的技术效果，具备创造性。

合议组于2022年10月31日向复审请求人发出第二次复审通知书，针对修改的权利要求1，在第一次复审通知书的基础上，合议组进一步指出：对比文件1试验例2验证NtZFP8提高植物愈伤组织分化效率。该试验例2相当于权利要求1步骤6)。本领域技术人员明了，通过转基因植株的筛选，己经获得了愈伤组织分化效率高的水稻品种，随后按照常规的方法即可制备转基因水稻的愈伤组织，即对水稻种子进行消毒处理（如75%乙醇、50%次氯酸钠），无菌水清洗4-5次，在灭菌的滤纸上晾干，然后在添加2，4-D的N6培养基（即N6D）上进行愈伤组织的诱导，选择胚性愈伤组织，转入含有细胞分裂素的MS分化培养基中培养进行不定芽分化，以及生根培养（公知2：张蕾，赵洁主编. 植物发育生物学实验指导[M].武汉：武汉大学出版社），KT也是常用的细胞分裂素，用于水稻胚愈伤组织的分化培养（公知3：钟鸣，马慧主编. 生物技术实验指导[M]. 北京：中国农业大学出版社）。其中，种子消毒、愈伤诱导和分化的条件都是常规调整，N6D和MSNK培养基也是常规培养基，容易配制。因此权利要求1不具备创造性。

关于复审答复意见，合议组进一步认为：权利要求1虽然限定了消毒、愈伤诱导培养基N6D和分化培养基MSNK等条件，但这只是愈伤组织分化培养中的十分有限的条件，而且权利要求1和实施例2中N6D培养基和MSNK培养基的组分撰写有多处不清楚的地方。转基因水稻提高了多少效率，这是转基因水稻品种本身所具备的效果，通过有限的试验对愈伤组织的诱导和分化条件进行常规优化调整，进行简单的验证试验即可确定。

复审请求人于2022年12月01日提交了意见陈述书，未修改申请文件，复审请求人认为：权利要求1的技术方案就是实施例2的技术方案，可以达到实施例2结果所示的100%愈伤分化效率的效果。人们尝试了各种办法，水稻分化率始终无法达到100%。文献1报道，过表达SERKI只能将愈伤分化率从72%提升到86%，提升幅度十分有限。这表明本申请取得了预料不到的技术效果。

在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。

专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。根据该条款，发明有突出的实质性特点，是指对所属技术领域的技术人员来说，发明相对于现有技术是非显而易见的。如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的，也就不具备突出的实质性特点。

权利要求1请求保护一种制备分化效率高的水稻愈伤组织的方法，其特征在于，由下列步骤组成：

1）将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段构建到pCAMBIA1301载体上，得重组子；

2）将重组子转化到感受态农杆菌EHA105内，得重组农杆菌；

3）将重组农杆菌悬浮于含有乙酰丁香酮的AAM培养基中，加入水稻愈伤组织进行共培养，3天后取出；

4）将愈伤放入含有50 mg/L潮霉素的N6D培养基筛选2次，得抗性愈伤；

5）使抗性愈伤分化成苗，即得到愈伤组织分化效率高的水稻品种；

6）将所得水稻品种按照如下方法制备愈伤组织：

1）水稻种子消毒：

70%酒精30s，6%次氯酸钠15min，蒸馏水清洗5次。

2）愈伤诱导及分化：

种子平铺放置于N6D培养基上，生长10天后将愈伤组织切下放入MSNK培养基上培养3-4周；

所述N6D培养基按照如下方法制备：取3.98g N6盐混合物、10 mL N6-vitamin、0.l g肌醇、0.3 g酪氨酸、2.878 g脯氨酸、5mL 200X 2,4-D、30 g蔗糖、3g gellan，加水至总体积1 L，调pH为5.8；

所述MSNK按照如下方法制备：取4.6g MS、10 mL MS-vitamin、0.1 g肌醇、2 g酪氨酸、1mL 1000 NAA、20 mL 50 KT、30 g蔗糖、30 g山梨醇、3g gellan，加水至总体积1 L，调pH为5.8。”

对比文件1公开了提高烟草愈伤组织培养分化效率的方法，将SEQ ID NO.1所示的NtZFP8基因（与本申请的SEQ ID NO.1相同）插入pCAMBIA1301载体得到重组载体，重组载体转化农杆菌EHA105感受态，得到重组农杆菌，将重组农杆菌进行培养，重组农杆菌侵染烟草叶盘，置于培养基中暗处培养2d，将愈伤组织转入筛选培养基中筛选，练苗，收集种子，在含有氨苄霉素的MS培养上进行筛选，选择正常生长的苗，收集种子，继续培养筛选，取阳性种子进行分子鉴定，获得基因稳定表达的纯合体，即获得愈伤组织的分化效率提高的烟草，并于试验例2验证NtZFP8提高植物愈伤组织分化效率（即转基因烟草愈伤组织的制备），按照试验例1的方法获得叶盘（即将NtZFP8超表达的烟草种子用1%次氯酸钠消毒，至于灭菌纸上晾干，放于MS固体培养基上萌发和培养，15 d后，取叶片用打孔器获得叶盘），置于含有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸的培养基上培养，10 d后获得愈伤组织并统计，15 d后统计再生苗。该试验例2相当于权利要求1步骤6）（参见说明书第0026-0049段）。由此可见，对比文件1公开了SEQ ID No.1用于愈伤分化效率高的烟草品种的培育方法。权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1用于水稻品种，对比文件1用于烟草；（2）限定了共培养培养基为含有乙酰丁香酮的AAM，筛选培养基为50 mg/L潮霉素的N6D，并限定共培养天数和筛选次数；（3）限定了水稻愈伤组织的制备步骤6）。基于上述区别，权利要求1实际解决的技术问题是：如何培育愈伤分化效率高的水稻品种并制备水稻愈伤组织。

然而，（1）对比文件1还记载了NtZFP8基因转入植物中，提高植物外植体和愈伤组织分化效率的构思，并且提到了水稻愈伤组织分化效率的问题。由此可见，对比文件1暗示了NtZFP8基因可转入其他植物如水稻中以解决愈伤组织分化效率的技术问题。而且，本领域技术人员知道，水稻不仅是植物基因功能研究的常规模式植物，也是最重要的粮食作物之一，各种植物相关功能基因用于水稻转基因研究是容易想到的，因而在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员有动机将NtZFP8基因转入水稻中，并预期对水稻愈伤分化效率有提高的作用。（2）悬浮农杆菌感染愈伤组织培养基为添加终浓度200mol/L AS（即乙酰丁香酮）的AAM培养基，N6D是常规的水稻愈伤诱导（继代）培养基，潮霉素是转基因水稻中常规使用的筛选标记，水稻的转基因和愈伤组织的培养是本领域技术人员熟知的，潮霉素浓度、共培养天数和筛选次数都是通过常规调整即可得到的。（3）对比文件1公开了烟草愈伤组织的制备过程，即种子消毒和萌发获得外植体，然后进行愈伤诱导和分化。本领域技术人员明了，通过转基因植株的筛选，己经获得了愈伤组织分化效率高的水稻品种，随后按照常规的方法即可制备转基因水稻的愈伤组织，即对水稻种子进行消毒处理（如75%乙醇、50%次氯酸钠），无菌水清洗种子4-5次，在灭菌的滤纸上晾干，然后在添加2，4-D的N6培养基（即N6D）上进行愈伤组织的诱导，选择胚性愈伤组织，转入含有细胞分裂素（如NAA）的MS分化培养基中培养进行不定芽分化，以及生根培养，KT也是常用的细胞分裂素，用于水稻胚愈伤组织的分化培养。其中，种子消毒、愈伤诱导和分化的条件都是常规调整，N6D和MSNK培养基也是常规培养基，容易配制。

因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。

对于复审请求人的意见，合议组认为：

本申请的说明书实施例2记载了转基因水稻分化能力检测，3株转基因水稻的愈伤组织分化率为100%。虽然限定了消毒、愈伤诱导培养基N6D和分化培养基MSNK等条件，但这只是愈伤组织分化培养中的十分有限的条件，而愈伤组织的分化效率的具体数值不仅仅取决于转入的基因和培养基，抗性愈伤分化成苗过程中所使用的外植体状态、试验样本的数量、培养条件、实验操作均会对分化效率的具体数值产生影响，比如复审请求人在提复审时提供的文献4，对同一烟草叶片采用相同方法进行愈伤组织诱导和分化培养，分化效率为60%-100%。此外，3株转基因水稻的实际样本基数是多少并不清楚，100%的分化率不一定具有统计学意义。现有技术中的各种办法不能使水稻愈伤分化效率提高到100%，并不意味着本领域技术人员无法获得本申请的技术方案以及无法获得100%的分化效率，对比文件1公开了SEQ ID NO.1用于愈伤分化效率高的烟草品种的培育，暗示了NtZFP8基因可转入其他植物如水稻中以解决愈伤组织分化效率的技术问题，在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员有动机将NtZFP8基因转入水稻中，并预期水稻愈伤分化效率提高。在获得NtZFP8基因转基因水稻的基础上，即己经获得了愈伤组织分化效率高的水稻品种，至于提高了多少效率，这是转基因水稻品种本身所具备的效果，通过有限的试验对愈伤组织的诱导和分化条件进行常规优化调整，进行简单的验证试验即可确定。另外如上分析，通过少量样本（3株）获得100%的分化率不一定具有统计学意义，不能表明取得了预料不到的技术效果。

综上，复审请求人的意见陈述没有说服力。

基于以上事实和理由，合议组作出维持国家知识产权局于2020年01月08日对本申请作出的驳回决定的审查决定。

本申请涉及NtZFP8基因新功能的创新性问题。对比文件1不仅公开了NtZFP8基因能提高烟草愈伤组织培养分化效率的方法，还记载了转NtZFP8基因能提高植物愈伤组织分化效率的构思，并且提到了水稻愈伤组织分化效率的问题。由此可见，在对比文件1的启示下，本领域技术人员有动机将NtZFP8基因转入水稻中来提高愈伤分化效率。此外，本方案中获得的3株转基因水稻愈伤分化效率达到100%，但因样本量不够，并不具有统计学意义。因此，本发明的技术方案是显而易见的，且技术效果没有取得令人信服的显著进步，不具备创造性。