第一作者：堵玉林通讯作者：谭蔚泓院士/吕一帆副教授通讯单位：湖南大学论文DOI：10.1002/anie.202215387 01 全文速览 细胞特异性核酸适配体为单分子水平研究膜受体提供了有力的分子工具。大多数核酸适配体的靶标受体在细胞表面高表达，且分布密集，运动速度快，难以进行原位分析。基于此，我们提出了一种基于随机抽样的分析策略，以充分发掘核酸适配体在膜受体分析领域的应用潜力。 02 背景介绍 众所周知，膜蛋白对生物体起着至关重要的作用，当细胞发生病理过程时，某些膜蛋白的表达和动力学可能会相应改变。这些与疾病相关的膜蛋白作为正常细胞和患病细胞之间的潜在生物标志物，占所有现代药物靶点的50%以上。在大多数情况下，确定这些与疾病相关的膜蛋白需要长期的证明和鉴定，只有有限种类的受体被鉴定为有效的标志物。我们团队通过cell-SELEX筛选技术得到的细胞特异性核酸适配体为膜蛋白的特异性识别提供了一种高效的替代方案。然而，在筛选过程中，核酸适配体与靶标受体的结合事件很难在单分子水平上被表征。此外，由于靶标受体在细胞表面往往高表达，分布密集，运动速度快，对靶标受体的原位分析检测也存在巨大挑战。 03 本文亮点 亮点1：对比传统的稀疏标记，采用配体稀释分析策略标记受体的过程具有均一性和稳定性，不易受细胞总数等外界条件干扰。亮点2：利用协同配体稀释分析策略，我们实现了局部超分辨的效果，在单分子层面成功观测到核酸适配体和单克隆抗体在同一个受体分子上的共定位，确定了核酸适配体与膜受体分子的精确结合位点和具体结合模式。亮点3：利用配体稀释分析策略，我们实现了对活细胞表面高表达受体分子密度及运动情况（二维运动和三维运动）的分析。 04 图文解析 当使用带有荧光团标记的sgc8c探针来标记靶蛋白PTK7时，由于PTK7在CEM细胞上密集表达，那么观察到的荧光将过于密集，从而无法解析单个分子。故在配体稀释分析策略中，我们同时使用两种探针：荧光标记的探针与无荧光标记的探针。通过调整荧光标记与无荧光标记探针的比例使相邻两个荧光光斑间的距离足够大时，单帧图片中所有光斑的数量和准确坐标便能被有效识别。此外我们采用玻璃支撑的脂质双层膜来模拟细胞膜和采用胆固醇修饰的DNA四面体来模拟膜受体蛋白，验证了配体稀释分析策略用于膜受体检测的可能性。 图1 配体稀释分析策略的原理及验证 接下来我们将配体稀释分析策略用于测定CEM细胞表面PTK7受体的密度，结果显示PTK7在细胞表面的平均密度约为450个/μm2。为了验证结果的可靠性，我们还将PTK7单克隆抗体作为探针重复配体稀释过程，测得结果与核酸适配体一致，由此验证了配体稀释分析策略用于测定细胞表面高表达受体蛋白密度的有效性。除此之外，我们还分别用稀疏标记和配体稀释策略对CEM细胞表面受体的密度进行测定。发现当直接对受体蛋白进行稀疏标记时，单个细胞上荧光探针标记的受体密度很容易受到细胞总数影响。而使用配体稀释分析策略时，单个细胞上荧光探针的标记密度能够得到有效控制，不受细胞总数影响。 图2 基于非线性回归的细胞表面受体密度分析 我们还通过配体稀释策略实现了在单分子水平上研究核酸适配体与靶标受体之间的结合模式。为此，我们首先提出了两种协同配体稀释策略以实现局部超分辨，并在单分子层面成功观察到核酸适配体和单克隆抗体位于同一个受体蛋白的共定位。使用高斯拟合对二者的距离分布进行分析，得到两者结合位点之间的距离为13.99±0.32 nm。进一步我们结合计算机辅助的分子对接和分子动力学模拟来分析预测PTK7上sgc8c的结合位点，发现sgc8c在PTK7上的结合位点处于Ig3和Ig4之间的凹陷处。 图3 基于局部超分辨的适配体结合和抗体结合在单个受体上的共定位和分化 此外，我们利用配体稀释分析技术的随机取样特性对活细胞表面高表达受体的运动行为进行分析，并绘制出HCT116活细胞表面PTK7分布的时间相关热图。每一帧之间PTK7分布的变化十分明显，通过提取每一帧中单个受体的精确位置坐标，我们可以对受体在细胞膜上的运动轨迹进行追踪。实验结果表明PTK7在短时间内表现为自由扩散行为，最终转变为受限运动，我们推测PTK7在扩散过程中可能会移动到丝状伪足上，从而将其轨迹限制在一个方向。 图4 适体结合模式模拟和使用LDA的PTK7的单分子运动分析 最后，我们将配体稀释分析策略与入射角相关计算协同结合，获得每个受体的相对高度分布，从而可以精确定位单个受体分子包括轴向坐标在内的三维坐标，并实时跟踪单个受体分子的横向运动和轴向涨落，实现活细胞表面高密度受体的三维运动分析。PTK7在细胞表面上的轴向运动范围约为±100 nm，且轴向速度明显慢于横向速度，这是由于轴向运动受到细胞膜限制。同时我们还比较了核酸适配体与单克隆抗体分别作为探针时受体的运动速度，发现受体的横向运动存在显著差别，这与两种探针的尺寸与分子量大小有关。 图5 基于LDA用于活HCT116细胞表面PTK7的三维运动分析 本文提出的配体稀释分析策略，为原位表征适配体结合提供了一种易于实施的策略，并证明了核酸适配体在基于单分子定位的成像和动态分析中的潜力，这可作为未来单分子水平研究的指南，以了解膜蛋白的实际分布、运动和相互作用模式，并在理解生命活动基本规律、指导疾病的药物研发和诊疗中发挥重要作用。在将来可以利用其他膜探针，如抗体、两亲性分子等替代核酸适配体与该方法结合，实现更广泛的应用。该研究成果发表于国际化学领域权威期刊《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。该论文第一作者为湖南大学的博士生堵玉林，通讯作者为湖南大学谭蔚泓院士和吕一帆副教授。该研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、深圳市优秀科技创新人才培养项目的大力资助。 论文信息： Du Y, Lyu Y, Li S, et al. Ligand Dilution
Analysis Facilitates Aptamer Binding Characterization at the Single‐Molecule
Level[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2022.https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202215387 05 作者团队介绍 湖南大学分子科学与生物医学实验室
（MBL）于2010年正式成立，由中国科学院谭蔚泓院士任学术带头人，是一个跨院系的新型交叉学科研究机构。实验室以化学学科为基础，利用化学生物传感与计量学国家重点实验室的研究优势，结合自身在分子科学、材料科学、生物学和纳米技术等领域的研究优势，设计合成新的分子工具，用于分子医学的难点和前沿研究，力求为分子医学和转化医学的更深入发展提供一个革命性的科学研究和技术交流平台。团队的主要研究方向有化学生物学、生命分析化学、功能材料与纳米科学、分子医学等。具体研究内容包括：发展化学生物传感新方法和新技术，设计和开发新型功能纳米材料和分子探针；开展分子医学的基础和应用研究，实现重大疾病相关生物分子的高灵敏检测及早期诊断；借助生物分析和功能纳米材料的方法和手段，整合分子生物学、基因组学和蛋白质组学的技术，搭建多学科交叉研究平台，寻找对恶性肿瘤的早期诊断、治疗及预后有指导意义的分子标志物和分子靶标；促进基础研究与临床应用的紧密结合，为转化医学和个体化医疗提供革命性的分子工具。近些年来，团队在核酸适体以及基于核酸适体的生物分析化学和化学生物学研究领域取得突破性成绩。团队在国际上率先提出了核酸适体活细胞筛选的新概念，建立了以活细胞为靶标的核酸适体筛选方法，利用获得的分子探针实现了癌症等多种重大疾病细胞的特异性识别，为解决细胞分析化学缺乏分子探针的难题开辟了新途径；提出了系列核酸适体分析化学新原理：利用核酸适体发现了白血病等癌症的疾病相关蛋白，测定了这些蛋白的结构参数，建立了这些蛋白的定量分析和光学成像新方法，系统研究了核酸适体细胞识别的分子基础；探索了纳米生物学和分析化学交叉研究新方向：开发了DNA胶束、DNA水凝胶等生物纳米新材料，结合核酸分子工程构建了多种信号放大新策略，发展了基于核酸的新型靶向给药体系，为重大疾病诊疗提供了重要的分子工具和平台。
谭蔚泓院士简介谭蔚泓，中国科学院院士、发展中国家科学院院士。谭蔚泓教授长期致力于分子医学、生物分析化学、化学生物学的前沿研究与临床应用，在Science等学术刊物上发表学术论文900余篇，H-index 158，引用次数逾85,000次。2014-2021连续八年入选全球高被引研究人员名单。研究成果分别获2014年和2020年国家自然科学二等奖，2018年何梁何利基金科学与技术进步奖，2018年美国化学会“光谱化学分析奖”，2019年美国PITTCON分析化学成就奖、2019年Ralph N. Adams生物分析化学成就奖。2005年当选美国AAAS Fellow，2015年当选中国科学院院士，2016年当选发展中国家科学院院士。 吕一帆副教授简介吕一帆，湖南大学化学化工学院副教授。研究方向包括DNA动态逻辑回路的仿生学应用、功能化DNA结构自组装的构建与生物学应用、生物分子的单分子荧光成像与运动分析、分子识别探针的构建与生物分析应用等。迄今已在国际著名期刊上发表SCI论文30余篇，其中以通讯作者或第一作者（含共同）在Nature Nanotechnology，Science Advances, Chem，Journal of the American Chemical Society，Angewandte
Chemie International Edition，Nature Protocols等著名期刊发表论文15篇。 相关推荐1. 仪器表征基础知识汇总2. SCI论文写作专题汇总3. Origin/3D绘图等科学可视化汇总4. 理论化学基础知识汇总5. 催化板块汇总6. 电化学-电池相关内容汇总贴7. 研之成理名师志汇总更多科研作图、软件使用、表征分析、SCI 写作、名师介绍等干货知识请进入后台自主查询。