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点评 | 黄河 (浙大一院）、王立群 （星奕昂生物科技公司）CAR-T细胞治疗是通过在T细胞上表达嵌合型抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR），使其在患者体内识别并杀伤肿瘤细胞的一种肿瘤免疫疗法。虽然多款上市的CAR-T药物在血液肿瘤中展现出显著的疗效，但其在治疗实体瘤方面一直疗效不佳，其中一个重要原因是CAR-T 细胞容易功能耗竭。如何解决功能耗竭这一难题是实体肿瘤CAR-T治疗中的热点与难点。近期研究发现，多数实体肿瘤CAR受体在无肿瘤抗原刺激时，仍然会产生一种持续的基底信号（tonic signal），而这种基底信号，会持续刺激CAR-T细胞，导致CAR-T细胞功能耗竭。同时，近期临床研究也表明，基底信号的过度不足也会影响CAR-T细胞的持续和疗效。因此，了解基底信号形成和维持的机制可以帮助设计高持续、抗耗竭的CAR-T细胞，提高CAR-T疗效。目前，领域内对CAR的基底信号的研究匮乏，基底信号是如何形成的、基底信号又是如何影响CAR- T疗效等一系列重要科学问题尚待解决。2023年3月8日，上海科技大学生命科学与技术学院王皞鹏研究团队与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院吴海涛团队、中科院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦实验室，以及上海市第一人民医院宋献民课题组合作在Cell Research上发表了题为 Tuning Charge Density of Chimeric Antigen Receptor optimizes tonic signaling and CAR-T cell fitness的研究论文，成功解析了CAR-T细胞中基底信号形成的机制，提出了基于基底信号调控的CAR理性设计（rational design）系统；通过此全新的设计角度，可显著提高CAR-T细胞的存活优势（fitness）和抗肿瘤效果，为推进CAR-T细胞治疗实体瘤提供了新策略。已有研究表明，CAR受体胞外scFv结构是引发CAR-T细胞产生基底信号的主要原因，但是其中的具体机制尚不明确。为了探索这个问题，研究团队分析了临床上常见的10种CAR-T细胞，发现它们均存在不同强度的基底信号。10种CAR-T除了scFv外的结构几乎完全一致，于是研究团队将各种CAR scFv结构的理化性质与其基底信号强度作相关性分析。通过不断筛选，研究团队发现scFv结构表面的正电荷斑块（PCP）结构与CAR-T细胞的基底信号强度呈高度正相关性，提示PCP介导的静电作用可能是CAR-T细胞基底信号的产生机制。为了证明这个研究假设，研究团队首先通过提高盐离子浓度加强静电屏蔽的方法减弱PCP之间的静电作用强度。研究团队选择了两个基底信号强度最高的CAR作为研究对象：靶向胶质瘤的GD2.CAR和靶向头颈肿瘤的CSPG4.CAR，同时以基底信号最弱的靶向白血病的CD19.CAR作为对照。结果显示，常规情况下GD2和CSPG4 CAR会在T细胞膜表面自发地聚集成簇产生基底信号，而在高盐条件下它们聚集的情况显著地减弱。相应地，这两种CAR-T细胞在高盐环境下基底信号减弱，耗竭程度减轻，抗肿瘤活性得到了显著提升。随后，通过点突变的方式直接缩小GD2.CAR的PCP，减弱CAR受体间的静电作用。研究团队发现，PCP缩小后的GD2.CAR-T细胞基底信号强度随着突变程度逐步递减。作为代表性的优化结构，GD2F4.CAR-T细胞的耗竭程度明显改善并且显示出了更强的抗肿瘤活性。调控CSPG4.CAR的PCP也发现了一致的结果。反之，又通过点突变的方式直接增大CD19.CAR的PCP，发现突变后的CD19.CAR-T细胞不仅基底信号强度有所增加，在小鼠体内的持续时间也得到了延长，因此抗肿瘤效果也有所加强。这些结果与增强CD22.CAR-T细胞基底信号提升其疗效的研究相符，说明一定强度的基底信号使得CAR-T细胞在体内存活得更好。此外，研究团队还证实了这种在scFv框架序列的点突变不会影响CAR-T对肿瘤抗原的特异性和亲和力。于是研究团队提出了以下模型（图1）。大多数靶向实体瘤的CAR-T细胞往往会因为基底信号强度过高导致自发耗竭，如GD2、CSPG4 CAR等，可以通过提高盐离子浓度或者缩小PCP的方法来减弱实体瘤CAR-T细胞的基底信号，提高它们的体内生存优势。然而，某些治疗血液肿瘤的CAR-T细胞也可因为基底信号强度不足导致持续能力不够，如CD19、CD22 CAR等，设计者又可以通过增大PCP的方法来增强该类CAR-T细胞的基底信号，增强它们的体内持续能力。综上所述，该研究发现几乎所有CAR受体都存在不同强度的基底信号，而CAR受体表面PCP介导的静电作用是基底信号的重要发生机制。CAR基底信号对CAR-T抗肿瘤功能的影响是双向的，不能简单概括为有害或有益。研究者提出了一个峰尖模型（Peak Theory）:过于微弱的CAR基底信号不能支持CAR-T细胞的体内稳态增殖，导致CAR-T 细胞体内持续能力受限;与之相反，如果基底信号过于强劲，会持续刺激CAR-T细胞，使之功能耗竭。通过调整盐离子浓度或者点突变优化PCP结构可以做到定向调控基底信号强度，使CAR-T细胞处在最佳的活性状态，进而在回输患者后发挥最佳的抗肿瘤疗效。更重要的是，该研究表明PCP的分数在46-56时，可以产生最优的基底信号和抗肿瘤活性。因此，在设计下一代CAR时，CAR-T设计者可以通过调整PCP介导的基底信号强度，理性设计CAR的结构，从而大大加速CAR-T的研发效率和进程，推动肿瘤尤其是实体瘤CAR-T治疗研究领域的发展进步。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法近年来取得了长足的进步，美国FDA批准了六个CAR-T产品用于血液肿瘤的临床治疗，标志着CAR-T技术的巨大成功。然而，近年来发现CAR-T细胞功能耗竭和体内持续性不足等瓶颈严重限制了CAR-T疗法的进一步临床应用。TCR、BCR等天然的免疫抗原受体能够产生不依赖于抗原的自发的基底信号（tonic signal）。科学家发现人造的免疫抗原受体CAR也会产生类似的基底信号，并且，越来越多的临床研究表明CAR-T细胞的功能耗竭和持续性不足都与CAR的基底信号相关：多项研究证实基底信号是引起多种实体瘤CAR-T细胞耗竭和功能不全的重要原因；但也有报道显示增强基底信号提高了血液肿瘤CAR-T细胞的持续性和抗肿瘤效果，这二者之间相互矛盾的结果说明了加深对基底信号研究认识的重要性和迫切性。然而遗憾的是，关于基底信号发生机制的认识仍然十分有限。上海科技大学王皞鹏教授领衔的多方合作研究成功揭示了CAR受体之间的静电作用是CAR-T细胞产生基底信号的重要机制，并首次提出了基底信号调控CAR-T细胞功能的理论模型。根据理论模型，血液肿瘤CAR-T细胞往往因为基底信号太弱导致CAR-T细胞持续性有限，而通过增强CAR受体间静电作用的方式可以增强其基底信号进而提高CAR-T细胞在体内的持续性。与之相反，实体瘤CAR-T细胞往往因为基底信号过强导致CAR-T细胞自发耗竭而功能不全，通过减弱CAR受体间静电作用的方式可以降低其基底信号进而改善CAR-T细胞的耗竭状态。更进一步，研究团队建立了一套定向调控CAR基底信号的技术体系，可以在不改变CAR特异性的前提下对CAR基底信号进行量化调整。这就像提供了一个CAR设计的“工作指南手册”， 根据这个手册，科研人员不仅了解了CAR改进的正确方向，也知道了如何实现优化。这一原创性的研究成果为CAR-T细胞研发领域带来了新的设计理念和评价指标，我将期待基底信号优化后的CAR- T疗法在临床上的优异表现。肿瘤免疫疗法在2013年被美国《科学》杂志评为年度十大科学突破，迎来了一波创新药的飞速发展。中国也以非常快的速度跟进研发缩小与国外的差距，接近世界先进水平。CAR-T细胞治疗作为最具代表性的新型肿瘤免疫疗法之一，在血液肿瘤的治疗中成果显著，已有两个产品获批，还有多个待批产品。然而，CAR-T疗法仍然存在复发的问题，尤其在实体瘤的应用研究中持效问题更为突出。其中非常重要的一点就是靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞往往存在自发耗竭的缺陷。目前多项研究已经确定CAR-T细胞内一种抗原非依赖性的基底信号（Tonic signaling）的持续刺激是导致CAR-T细胞耗竭的主要原因。然而，基底信号产生的机制尚不清楚，因此也就缺乏调控CAR-T细胞基底信号的有效方法。王皞鹏教授等的这篇Cell Research论文证明，CAR受体表面正电荷斑块介导的静电作用是CAR-T细胞产生基底信号的重要机制，这也是国际上首次关于CAR-T细胞基底信号具体产生机制的报道，显著地增加了学界对CAR-T细胞基底信号的认识。同时，研究者们还发现通过增大或缩小正电荷斑块的面积可以直接增强或减弱CAR-T细胞的基底信号强度，而受调控后处在最合适范围的基底信号强度可以促进CAR-T细胞的健康状态，使它获得最佳的抗肿瘤活性。此外，对于基底信号过强导致自发耗竭的CAR-T细胞，研究者们发明了可以通过简单地提高培养环境盐离子浓度的方法来降低CAR受体间的静电作用，进而降低CAR-T细胞的基底信号强度和耗竭程度，最终达到长效抗肿瘤效果的目的。这项令人印象深刻的创新性工作为CAR-T疗法保持更高的完全缓解率，特别是对推进实体瘤疗效的进一步研究应用做出了重要贡献。这项研究也给领域带来了一些启发。已经有数据表明，将CAR表达在自然杀伤细胞（NK）和巨噬细胞（Macrophage）上产生的CAR-NK和CAR- Macrophage细胞亦可以获得对靶向肿瘤细胞的精准杀伤能力。其中，由于NK不会引起GVHD，CAR-NK作为通用型现货产品供异体使用的研究引起了很大的关注。那么这种基底信号在通用性CAR-NK产品中是否同样重要？对其进行调控是否有望进一步提高通用型CAR产品的抗肿瘤效果？提高盐离子浓度的方法简单易行，是否可以在CAR产品开发中进一步推广应用？相信随着今后基底信号在更多CAR产品中的探索验证，该项技术的应用范围有望进一步拓展，基于CAR的免疫治疗研究发展也会迈向新的高度。https://www.nature.com/articles/s41422-023-00789-0制版人：十一
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