背景
Dicer是一种多结构域核糖核酸酶 (RNase) III，通过将双链RNA (dsRNA)切割成长度为21-25个核苷酸 (nt)的小RNA，在RNA沉默中发挥关键作用。内源性siRNAs和miRNAs分别由长RNA双链体和RNA发夹产生。多细胞动物物种中的miRNA通路涉及另一种RNase III，Drosha，它能切割初级miRNA (pri-miRNA)转录物，释放出前体miRNA，即约70 nt的发夹，具有特征性的2-nt 3′突出端。Dicer切割前miRNA，产生约22 nt的双链体，两端有2-nt 3′突出端。装载到Argonaut (Ago)蛋白上后，双链体的一条链仍作为成熟的miRNA存在，其功能是指导与同源靶的碱基配对。靶向特异性依赖于加工的精确度，因为即使加工位点的微小改变也可能改变对靶结合至关重要的“种子”序列 (相对于引导RNA 5’端的2-7-nt区域)。
简介
2023年2月23日，来自韩国基础科学研究院 (IBS)的Young-Yoon Lee及其团队在Nature (IF: 69.504)杂志上发表名为Sequence determinant of small RNA production by DICER的研究[1]。
研究要点
RNA沉默依赖于Dicer对双链RNA的特异性高效加工，产生微小RNA (miRNAs)和小干扰RNA (siRNAs)。然而，我们目前对Dicer的特异性的了解仅限于其底物的二级结构：一个由约22个碱基对组成的双链RNA，具有2个核苷酸的3’突出端和一个末端环。在这里，我们发现有证据表明，除了这些结构特性之外，还有一个依赖于序列的决定因素。为了系统地研究前体miRNAs (pre-miRNAs)的特征，我们对pre-miRNA变异体和人类DICER (也称为DICER1)进行了大规模平行分析。我们的分析显示，在切割位点附近有一个高度保守的顺式作用元件，称为“GYM基序” (配对的G、配对嘧啶和错配的C或A)，在切割位点附近。GYM基序促进了在特定位置的加工，并且可以覆盖先前在pre-miRNA的5 '和3 '末端发现的'尺子'样计数机制。将这一基序整合到短发夹RNA或Dicer-底物siRNA中可以增强RNA干扰。此外，我们发现DICER的C-末端双链RNA结合域 (dsRBD)可以识别GYM基序。dsRBD的改变以基序依赖性的方式减少加工和改变切割位点，影响细胞中的miRNA库。特别是，在dsRBD中与癌症相关的R1855L替代严重损害了GYM基序识别。这项研究揭示了多细胞动物Dicer识别底物的古老原理，并暗示了其在RNA治疗学设计中的潜力。
主要结果
序列基序的识别
为了全面询问上茎区，我们实施了一种大规模平行试验，能够对大量变体进行定量检测 (图1a)。简而言之，我们通过随机化结构模型中预测与DICER接触的上干5-bp窗口内的序列 (相对于3p链的切割位点-1至+3)，合成了1048576个pre-let-7a-1变异体 (图1b)。与纯化的人DICER蛋白短暂孵育 (其中5%的底物池被切割)后，未切割的RNA被凝胶纯化，并通过允许有效连接结构RNA的精确定量测序 (AQ-seq)方法进行测序。通过将输入群体中每种变体的比例除以反应后未切割的读段的比例来量化处理效率 (图1a)。我们将该指标称为“切割评分”。
图1. 大规模平行实验确定了GYM基序
替代分子
接下来，我们探讨了在内源性miRNA成熟的背景下，GYM基序是否具有生物学意义。野生型或突变型DICER蛋白在DICER敲除的HCT116或HEK293T细胞中异位表达 (图3a)。通过AQ-seq方案对小RNA进行测序，以最大限度地减少量化偏倚，从而能够可靠地比较miRNA亚型 (isomiRs)。当dsRBD缺失或R1855和E1859残基突变时，miRNA丰度降低 (图3b)。一些保守的和丰富的miRNAs受到强烈的影响，促使我们研究这些miRNAs是否以gym依赖性的方式产生。体外处理实验表明，dsRBD的改变降低了pre-miR-27b、pre-miR-21、pre-let-7d、pre-let-7f-1和pre-let-7i上的DICER活性，因此需要更长的孵育时间 (图3c)。在pre-miRNAs中，GYM基序的弱化变化降低了加工效率，当dsRBD突变时，这种GYM基序效应减弱。综上所述，我们的数据表明，在细胞和体外，GYM基序和DICER dsRBD之间的相互作用促进了miRNA的加工。
图3. 内源性miRNAs由dsRBD以GYM基序依赖性的方式调控
GYM基序改善了RNA干扰
在确定了GYM基序是Dicer介导加工的一个强决定因素后，我们质疑了其对依赖性细胞Dicer产生siRNA的短发夹RNA (shRNA)和DICER底物siRNA (DsiRNA)RNA干扰的影响。shRNA模拟前miRNA，但包含有一个5’三磷酸基团和一个3’突出端，带有3-5个源于RNA聚合酶III终止信号的尿苷。这种非最佳的末端结构会损害DICER的加工，这对shRNA介导的干扰造成了不利影响。为了测试GYM基序是否可以覆盖末端依赖性，我们构建了具有可变评分的GYM基序的shRNAs (图4a)。具有高评分GYM基序的shRNA产生最高水平的siRNA产物 (图4b)和最有效的基因沉默活性 (图4c)。
图4. GYM基序增强了基因沉默的效力
结论及展望
总而言之，本研究结果揭示了DICER识别底物的一个完整和保守的机制，并提供了一个框架来理解DICER如何产生小RNA来进行生物和治疗调控。此外，我们在DICER中发现了一种癌症相关T替代分子 (R1855L)，该替代分子会破坏对GYM基序的识别，这一发现为深入了解这种替代分子的影响提供了依据。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05722-4
参考文献
1.Lee Young-Yoon,Kim Haedong,Kim V Narry,Sequence determinant of small RNA production by DICER.[J] .Nature, 2023, undefined: undefined.
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