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来源：研之成理收集编辑：LHSRYY
https://doi.org/10.1038/s41557-023-01154-9理解Mo固氮酶(铁钼辅基)催化辅因子中的化学键是构建生物固氮机制的基础。实现这一目标的一个挑战是，基于57Fe的光谱数据综合了所有7个Fe位点的响应，因此无法将单个光谱响应映射到三维结构中的特定位点。1.本工作通过将57Fe掺入铁钼辅基的单个位点来解决将单个光谱响应映射到三维结构中的特定位点的挑战。2.通过对静息态(resting state)的光谱分析，了解了终端Fe1位点的局域电子结构，包括其氧化态和自旋取向，进而了解了整个团簇的自旋耦合方案。3.本工作对氧化静息态和固氮过程中的第一个中间体也进行了表征，并与静息态进行了比较，为铁钼辅基的氧化还原化学提供了分子水平的见解。▲图1. 利用位点选择性同位素标记来理解生物固氮的机制1、固氮酶催化N2还原为NH3 (图1a)，并伴随着Haber-Bosch过程，负责产生支持地球上生命的绝大部分固定氮。然而，铁钼辅基中开放壳层金属离子的数量极大地限制了计算分析的范围，并且在实验表征方面也存在一些挑战。2、虽然铁钼辅基中的Mo中心可以通过Mo特异性光谱技术进行选择性探测，但是单个Fe中心的研究更加困难。特别地，57Fe穆斯堡尔谱和电子-核双共振(ENDOR)谱所包含的丰富信息- -包括Fe的氧化态、Fe-S/C和Fe-Fe/Mo相互作用的共价性、局域自旋态以及局域自旋相对于总自旋的取向- -一直难以提取，因为57Fe谱数据无法映射到几何结构上(图1b)。3、本工作克服这些挑战的策略是用57Fe选择性地富集铁钼辅基的单个Fe位点(图1c)。本工作的发现揭示了MN态下的Fe1自旋取向和氧化态，实验上排除了大量潜在的铁钼辅基电子结构和之前计算研究中的测试预测。1、本工作将57Fe掺入铁钼辅基的Fe1位点的方法包括：(1)使用已报道的方法将Mo固氮酶(NifDK)的MoFe蛋白中的铁钼辅基提取到N-甲基甲酰胺(NMF)中；(2)使用螯合剂去除Fe1位点；(3)用57Fe重构Fe1位点；(4)将标记的辅因子重新插入到apo-NifDK中，其中包含P-簇而不是铁钼辅基。本工作首先通过电子顺磁光谱(EPR)研究了步骤(2)和(3)。2、当处于MN态(通过与连二亚硫酸钠(DTH)孵育获得))时，孤立的铁钼辅基在苯硫酚(图2b,顶部)存在的情况下表现出一个展宽的S=3/2信号。前期工作表明，用乙二胺四乙酸(EDTA)或邻菲罗啉处理孤立的铁钼辅基可以消除这一信号，而加入Zn2+或Fe2+可以逆转这一过程。3、类似地，本工作发现在EDTA处理的铁钼辅基(30 equiv.EDTA)中加入过量的57Fe2+(35 equiv.)可以恢复(图2b,底部)的EPR信号，并且，本工作推测该方案导致了位点选择性的57Fe掺入Fe1位点。▲图3. 位点选择性标记的holo-NifDK样品的制备与表征1、本工作随后用EDTA处理M (57Fe7)和自然丰度自然丰度的Fe2+生成了位点选择性标记的样品Nif DK-M(57Fe6)，用EDTA处理自然丰度的铁钼辅基后再用57Fe2+生成了Nif DK-M(57Fe1) (图3a)。2、这些样品与Nif DK-M(57Fe7)一样，表现出完全的C2H2还原活性，并且干净地显示出天然Mo固氮酶静息态的S=3/2 EPR信号(图3b)，表明本工作用EDTA和Fe2+进行生物合成后处理并不影响铁钼辅基的结构、组成或重新插入apo-Nif DK产生活性holo-Nif DK的能力。3、在MN态(图3c、d)时，这些样品的Mössbauer谱和ENDOR谱都显示出57Fe标记的基本定量位点选择性。从NifDK-M(57Fe6)的光谱中完全消除ν+峰表明了对Fe1位点的高标记效率，而在NifDK-M(57Fe1)光谱中只观察到a2杜布莱，特别是尖锐和强烈的a1杜布莱的任何一个峰都没有任何强度，这证明了本工作方案的高选择性。▲图5. Nif DK-M(57Fe1)的研究揭示了铁钼辅基的Fe1位点的氧化还原变化1、目前的工作证实了A2和a2信号之间的这种对应关系，以及通过分析X波段ENDOR信号的场依赖性得到的超精细张量。在g3=2.01和g1=4.30记录的选择性标记NifDK-M(57Fe1)样品的Q波段ENDOR谱分别显示了集中于~10和~16 MHz的特征(图4a)，这些特征是由前面ENDOR模拟得到的单个57Fe位点的超精细张量和相关欧拉角重现的。2、值得注意的是，从位点选择性标记的NifDK-M(57Fe1)样品中获得的Fe1位点的δ和|ΔEQ|值高于Yoo等人基于NifDK-M(57Fe7)模拟得到的包括A2位点在内的任意Fe位点的δ和|ΔEQ|值。这表明Fe1位点具有稍高的电子密度，相应地，六个带Fe位点具有稍低的电子密度。3、由于能够区分Fe1和带状Fe位点的价态，本工作接下来对铁钼辅基的其他状态进行了表征，以确定是否在Fe1位点、带状Fe位点或两者都发生氧化还原变化。本工作从MOX开始，因为它的单个金属价态与MN的比较将揭示MN最还原的位点。本工作得出结论，在MN和MOX的相互转化中，Fe1位点及其双交换耦合伙伴具有氧化还原活性，因此这些金属中心是MN中最富电子的。https://www.nature.com/articles/s41557-023-01154-9更多科研作图、软件使用、表征分析、SCI 写作、名师介绍等干货知识请进入后台自主查询。