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多年来，加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授凯文·D·科贝特（Kevin D. Corbett）教授课题组，主要研究真核生物 Horma 和 Trip13，这些蛋白在有丝分裂、减数分裂和 DNA 修复中起着重要作用。2015 年，有论文称细菌中也有这些蛋白组分，这引起了他的注意。为此，他和课题组于 2016 年开启了相关研究。在此之前，该团队的叶巧真博士曾解析了线虫和人类的 Trip13 的结构。她说：“这让我成为这项研究的主力之一，后来我解析了包括 CD-NTase/Horma/Trip13 复合体结构在内的多个蛋白的晶体结构，并于 2020 年在 Molecular Cell 上以背靠背的形式发表了两篇论文。这一途径后被称为 Type III CBASS。”图 | 从左到右：叶巧真、凯文·D·科贝特（Kevin D. Corbett）。摄于 2021 年 7 月，恰逢 Kevin 在加州大学圣地亚哥分校建组 10 周年（来源：资料图）CBASS (cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling systems) 是细菌的一个免疫途径，包含 Type I、Type II 、Type III 和Type IV 四种类型，也是人类 cGAS-STING 免疫途径的前身。cGAS-STING 是人体的一个固有免疫途径，其中 cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) 可以感知外界病毒入侵并合成环状寡核甘酸 cGAMP (cyclic GMP-AMP)，进而激活基于 STING (stimulator of interferon genes) 的抗病毒反应。据悉，和 cGAS 类似的蛋白 CD-NTase (cGAS/DncV- like nucleotidyltransferases) 受到感应病毒的侵袭之后，会产生多种环状寡核苷酸信使，进而会激活相关酶去杀死被噬菌体感染的细菌，这一细菌免疫过程被称为 CBASS。2020 年，Kevin 利用生物信息学分析技术，发现 Type II (long) CBASS CD-NTase 的 C-端具有保守的甘氨酸或丙氨酸，和泛素分子的 C-端双甘氨酸相似，难道 CD-NTase 有泛素分子的性质？他敏锐地发现这会是一个开创性的研究课题，立马联系了美国科罗拉多大学博尔德分校生物化学系助理教授亚伦·怀特利（Aaron T. Whiteley），他们一拍即合，迅速开展了研究。在课题探索阶段，研究团队认为如果 CD-NTase 在此途径中是泛素分子，而 E1-E2 融合蛋白 Cap2 是泛素转移酶，那么 Cap2 应该可以利用 ATP 腺苷化 CD-NTase 的 C-端，从而共价结合到 Cap2 的活性位点的半胱氨酸上。为此，叶巧真分别纯化了两种蛋白，但是混合之后并没有观察到它们高分子的结合物，难道这项猜测是错误的？后来，她把两个蛋白的基因同时构建在同一个质粒上，以便在细菌里共表达，借此她观察到高分子量的蛋白带，这说明它们的确能共价结合在一起。后来，加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授周惠林实验室的全韵博士，使用蛋白质谱方法证明该高分子量条带同时包含 CD-NTase 和 Cap2，并鉴定到在 Cap2 上被 CD-NTase C-端修饰的位点，从而验证了课题组的原始猜想。接下来便是结构研究：他们先是设计了 Cap2 E1 部分和 CD-NTase C-端 370-381 片段的融合蛋白，并很快获得了 2.8 埃的晶体数据，但是结构无法获得解析。后来 AlphaFold 面世，于是叶巧真根据结构预测，进一步对融合蛋白的设计进行优化，获得了 1.7 埃的更高分辨晶体数据，从而解析了这一结构。同时，研究团队也获得了 Cap2 和 CD-NTase 复合体的结构。另据悉，活性状态的复合体比较不稳定，因此难以获得均一的样品，而理想状态是要突变 Cap2 的活性位点。但这也会带来一定困难：突变了活性位点之后，也会同时降低两个蛋白的亲和性。原因在于，Cap2 的活性位点往往也位于 CD-NTase 的结合位点附近。经过对多种菌株 Cap2 和 CD-NTase 复合体的筛选、以及对于各种突变位点的尝试，叶巧真终于拿到了 Cap2 在失活状态下和 CD-NTase 稳定结合的复合体，并获得了 3.9 埃的晶体数据。进一步地，在 Kevin 实验室的顾亚杰博士的助力下，通过采用冷冻电镜技术，他们解析了 2.7 埃的 Cap2 和 CD-NTase 复合体结构。然后进入生物化学方面的研究：包括研究 Cap2 和 CD-NTase 的相互作用，以及研究 Cap3 对于 CD-NTase 和 Cap2/CD-NTase 复合体的作用等。接下来则是噬菌体分析、以及寻找 CD-NTase 的靶目标。“这两步主要是合作者 Whiteley 课题组在做。我们两个实验室都是首次对泛素系统进行研究，相信他们和我们一样也遇到了不少困难。”最终，他们解析了 type II (long) CBASS 的作用机制，首次验证了在细菌中存在泛素系统，填补了这一领域的空白。而且经过确凿可信的结构对比，得出了真核生物非经典通路的泛素系统起源于细菌的结论。据了解，在该论文中最重要的数据便是高质量的 Cap2/CD-NTase 复合物的结构。针对 CBASS 系统，这些新颖的数据提供了关于重要蛋白的相互作用和功能的分子细节。在该工作里，关于噬菌体感染的研究上，课题组也给出了令人信服的酶学结论，为通过噬菌体治疗该类细菌所导致疾病提供了可靠依据。据了解，细菌免疫是近年来兴起的学科领域, 相关研究成果大大开阔了人们的视野：第一，这让人们可以向细菌取经：CRISPR-Cas 是细菌免疫的一个途径，通过研究人们发现了基因组编辑工具，该技术目前已广泛用于基础生物学研究、生物技术产品的开发和疾病治疗，相关学者已于 2020 年获得了诺贝尔化学奖。第二，可以帮助人们找出进化的印迹：Type II (long) CBASS 中的 E1 和 E2 及 Type III CBASS 中的 Horma 和 Trip13，都是首先在真核生物中发现，对细菌中的这些蛋白进行研究，能让学界更深入地了解其进化机理。第三，噬菌体有望用于细菌病的治疗：CBASS 细菌免疫途径最终的结果是被感染的细菌与噬菌体同归于尽，而且噬菌体只侵染细菌，这为人类细菌病的治疗提供了可靠的依据。据了解，在本次研究中通过质谱分析，他们还发现 CD-NTase 可以结合多种非特异靶目标，但其特异的靶目标尚未得到确定，因此课题组会继续跟踪研究。同时，生物信息学分析表明，类泛素系统在细菌中广泛存在。未来，他们也会继续探索该系统的作用机理。1.Ledvina, H.E., Ye, Q., Gu, Y.et al. An E1–E2 fusion protein primes antiviral immune signalling in bacteria. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05647-4