【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于化妆品、药品、食品等行业，微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术，筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的启动子。【方法】在Escherichia coli W3110培养基中外源添加不同终浓度的半胱氨酸，通过比较转录组学分析筛选转录水平显著响应半胱氨酸浓度变化的基因，融合目标基因的启动子片段与荧光报告基因egfp构建启动子文库，进一步测定不同半胱氨酸浓度条件下，含有不同启动子重组菌的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)荧光强度。【结果】筛选并挖掘了随着半胱氨酸浓度提高而转录水平显著提升的27个基因，并将基因的潜在启动子片段与荧光报告基因egfp融合构建启动子文库，筛选获得对半胱氨酸变化具备特异性响应的启动子P_E2。最后，对P_E2启动子−35区间隔区域AAAT进行随机突变，最终获得在1−7 g/L半胱氨酸浓度范围内特异性响应性能显著提高的启动子P_E2-33。【结论】本研究筛选表征的启动子P_E2-33是半胱氨酸特异性响应型启动子，为构建半胱氨酸特异性生物传感器并用于半胱氨酸高产菌的高通量筛选奠定了基础。