英文原题：In Silico Discovery of Small Molecule Modulators Targeting the Achilles' Heel of SARS-CoV-2 Spike Protein
通讯作者：Jianhui Huang, Niu Huang
作者：Qing Wang, Fanhao Meng, Yuting Xie, Wei Wang, Yumin Meng, Linjie Li, Tao Liu, Jianxun Qi, Xiaodan Ni, Sanduo Zheng
背景介绍
这三年来，肆虐全球的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）变化多端，从原始株开始，演化出阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔，直到现在奥密克戎又成为最流行毒株。但万变不离其宗，新冠病毒仍然遵循吸附、进入、脱壳、复制、成熟和释放的生命周期。针对新冠病毒进行的新药研发也是围绕着这几个关键节点进行。抑制已入侵细胞的病毒复制已有多个小分子药物批准上市或者紧急使用授权，如3CL蛋白酶抑制剂Paxlovid和Ensitrelvir，如RdRp抑制剂Remdesivir和Molnupiravir。但直接阻断新冠病毒进入细胞的途径，尚未有一款小分子药物进入临床研究，虽然这条途径已经被抗体和疫苗验证了其可行性，但这类生物药却经常因为新冠病毒刺突（spike）蛋白变异而失效。2020年Toelzer等人在Science等杂志连续发文，发现spike蛋白虽然多变，却具有一个非常保守的游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）结合位点，调控该位点可以有效地抑制病毒进入细胞，称其为新冠的阿喀琉斯之踵。可惜的是，因为其结合位点的特殊性，只报道过几个偶然发现的天然产物，尚未找到可成药的小分子。
文章亮点
1
该研究针对新冠病毒spike蛋白FFA结合位点，通过大规模虚拟筛选策略发现苗头化合物并随后对其进行优化，得到一系列低摩尔级别结合活性的小分子化合物。
2
该研究发现的小分子对原始毒株和奥密克戎BA.4的spike蛋白表现出类似的结合活性，一定程度上说明该类分子不易受病毒变异的影响。
3
复合物电镜结构解析确定了小分子SPC-14与spike蛋白的结合模式，并发现SPC-14的加入可以影响spike蛋白的构象偏好，使其构象平衡向ACE2无法结合的“关闭”状态移动。
图文解读
1. “新药发现的源泉”——生物学新机制
新冠病毒利用三聚体spike蛋白与宿主细胞ACE2受体结合以介导病毒的入侵。融合前的spike蛋白主要有两种构象状态，一种是三个受体结合域（receptor-binding domain，RBD）都处于“向下”构象的“闭合”状态，另一种是有一个或多个RBD处于“向上”构象的“开放”状态，而只有“向上”构象的RBD才能与ACE2结合（图1）。
图1.融合前spike蛋白的两种构象状态：“闭合”（左）和“开放”（右）
Toelzer等人在电镜研究中意外发现亚油酸分子结合在三个由spike蛋白中的两个相邻RBDs组成的复合型结合口袋中。与apo spike相比，亚油酸的结合使得三个RBDs之间的结合更加紧密，将spike构象锁定在无法与ACE2结合的“闭合”状态。研究团队对此FFA结合位点残基的保守性进行了分析，发现除R408外，其他残基都高度保守。这表明针对此保守的FFA结合位点开发小分子调节剂，有望以变构调节的方式改变spike蛋白的构象偏好，进而干扰病毒的进入过程。
2. “雪中送炭”——基于靶标结构的虚拟筛选
研究团队利用实验室多年发展的逐级虚拟筛选技术，先对内部的化合物库（32余万分子）进行分子对接，接着对打分排名前6万的化合物做更高计算精度的基于MM-GB/SA方法的优化及重打分，随后系统分析打分排名前1000的化合物结合模式，最终挑取了54个化合物做SPR实验验证（图2A）。结果表明，6个化合物显示微摩尔级别的结合活性（图2B）。随后，研究团队合成了SPC-2的含羧基基团的类似物，提高了化合物的活性及溶解性。并且，这类化合物对奥密克戎BA.4 spike蛋白（含R408S突变）也表现出类似结合活性，表明化合物的结合不受R408突变的影响。这在一定程度上佐证了“以不变应万变”的策略，用小分子调控FFA结合口袋，针对易突变的新冠病毒具有优势。
图2. （A）逐级虚拟筛选策略流程图及其（B）发现的苗头化合物
3. “有图有真相” ——复合物结构的测定
为了确定化合物的结合模式及其对spike蛋白构象偏好的影响，研究团队将纯化的spike蛋白与含羧基化合物SPC-14（KD = 9.5 μM）一起孵育制备冷冻电镜样品，并以单独的spike蛋白体系作为空白对照。电镜结果表明，对于有SPC-14加入的体系，约48%的粒子处于“关闭”状态，另外52%处于有一个RBD向上的“开放”状态。而对于apo spike体系，几乎100% 都处于一个RBD向上的“开放”状态，这表明SPC-14的加入会影响spike蛋白的构象偏好（图3A）。同时，在“关闭”状态的spike+SPC-14体系中发现了多余的电子云密度，此密度正好位于FFA结合位点并且SPC-14的分子结构能够很好的与其契合（图3B）。
图3.（A）spike蛋白在有无SPC-14加入下的冷冻电镜密度图及（B）spike蛋白与SPC-14复合物的电镜结构
总结与展望
此研究首次利用基于结构的虚拟筛选手段发现并且实验验证了一系列对spike蛋白有结合活性并且影响spike蛋白构象偏好的小分子，在传统实验筛选方法很难解决的情况下，计算可谓起到了雪中送炭的作用。“路漫漫其修远兮”，小分子的结合活性有待进一步提升，对变异毒株的构象偏好影响及抗病毒功能也亟待研究。希望本研究工作能激发更多的针对新冠病毒新机制、新靶标的小分子研发工作，毕竟基础研究的使命是探索未知、原始创新。
通讯作者信息
黄牛
博士，南开大学物理系学士，美国马里兰州大学博士，加州大学旧金山分校博后。现任职北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院，高级研究员。主要研究方向是发展基于物理学原理的计算化学方法，预测靶标和药物分子之间相互结合自由能，架起生命科学基础研究与首创新药研发之间的桥梁。在国际主流期刊上发表60多篇学术论文，已获得5项国际新药发明专利，并进入临床前研发阶段。荣获2013药明康德生物化学研究奖。
http://www.huanglab.org.cn
黄剑辉
博士，天津大学药学院教授。主要研究方向分子设计、立体化学、药物化学，致力于类天然产物、药物分子、手性助剂与功能材料分子的开发。发表学术论文50余篇，获得2017 年Thieme 化学期刊奖。
http://huang.tju.edu.cn
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ACS Cent. Sci. 2023, 9, 2, 252–265
Publication Date: February 8, 2023
https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01190
Copyright © 2023 The Authors. Published by American Chemical Society
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