自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM，1）酶因为其催化复杂化学反应的能力、以及其反应机理涉及形成自由基中间体等特性，近年来成为相关研究领域的热门课题。尽管自由基SAM酶能够催化的反应十分多样，包含碳碳键的生成与断裂、碳氢键的氧化或分子骨架的异构化等，它们的催化循环都始于活性位点里的铁硫簇（[Fe4S4]）与SAM之间的单电子转移（下图），此过程促使SAM分解成甲硫氨酸（2）和5′-脱氧腺苷自由基（3），后者则进一步与底物反应生成底物自由基，发生因酶而异的化学转变。有一类自由基SAM酶同时含有钴胺素（B12）辅因子，且大多数这一类型酶的功能是藉由甲钴胺催化底物的甲基化。美国德克萨斯州大学奥斯汀分校（UT Austin）的刘鸿文教授课题组在2017年与2022年分别报导了OxsB和AlsB为两个例外。[1,2] OxsB和AlsB在对应的辅助酶（即OxsA和AlsA）参与下，催化脱氧腺苷磷酸（4）的缩环反应并产生氧杂环丁烷核苷酸7和8（下图）。近期，该课题组进一步发现，OxsB与AlsB不但能催化缩环反应，也能够催化以4为底物有序的甲基化、碳碳键脱氢和自由基介导的碳碳键生成。 作者发现OxsB催化了至少三种与底物相关的分子的生成。通过使用同位素标记的底物或SAM追踪反应，并藉核磁表征证明此三个催化产物分别为甲基化的底物（9）、甲烯基化的底物（11）以及底物与5′-脱氧腺苷的二聚体（13）。此外，实验也揭示甲基化的机理始于5′-腺苷自由基攫取C2′的pro-R氢原子，产生底物自由基6（图），此一过程与AlsB催化的缩环反应有相同的立体选择性。作者因此推测底物（4）发生缩环或是甲基化的关键取决于B12辅因子是否被甲基化。甲基转移导致底物C2′的立体化学发生反转，使原来C2′的pro-S氢原子移动到核糖环的另一边，意即可以发生氢原子攫取的位置。甲基化的产物（9）也是OxsB（或者AlsB）仍能接受的底物，然而不同于其他B12依赖性的自由基SAM酶可以在同一修饰位点上进行多次的甲基化，以9为底物产生的自由基中间体（10）没有进行甲基化，而是发生单电子氧化形成甲烯基（11）。虽然11的C2'不再具有氢原子，其仍能被OxsB接受并且引发SAM的还原，导致5′-脱氧腺苷自由基（3）对甲烯基的加成。从9到13的两步化学反应在自由基SAM酶的催化中虽有先例，但在B12依赖性的酶家族中皆是第一次被观察到。 OxsB与AlsB除了催化其参与的生物合成路径中的缩环反应外，亦能对底物进行甲基化以及后续一系列的化学反应。此研究结果可提供两种思考：第一，相对于路易斯酸碱，自由基反应的活化能较低，因此自由基酶虽能够活化惰性键并催化复杂的化学反应，高能中间体的生成也容易导致副反应。第二，以演化的观点而言，高能中间体可以在微小的环境差异中导向迥异的催化结果，这或许是自由基SAM酶更易于演化出多样的催化能力的原因之一。关于OxsB与AlsB的催化仍然存有许多有趣的问题，包含缩环的机理与酶如何控制自由基中间体进入不同的催化循环，此些问题将会是今后课题组探讨的重点。 此工作近期发表在Journal of the American Chemical Society上，刘鸿文教授课题组的博士研究生李渝萱为第一作者，刘鸿文教授为通讯作者。 原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：Changing Fates of the Substrate Radicals Generated in the Active Sites of the B12-Dependent Radical SAM Enzymes OxsB and AlsBYu-Hsuan Lee, Yu-Cheng Yeh, Po-Hsun Fan, Aoshu Zhong, Mark W. Ruszczycky, and Hung-wen Liu*J. Am. Chem. Soc., 2023, 145, 3656–3664, DOI: 10.1021/jacs.2c12953 参考文献：1. Bridwell-Rabb, J., Zhong, A., Sun, H. G., Drennan, C. L., Liu, H.-w. (2017) A B12-dependent radical SAM enzyme involved in oxetanocin A biosynthesis, Nature 544, 322–326, 10.1038/nature21689.2. Fan, P.-H., Geng, Y., Romo, A. J., Zhong, A., Zhang, J., Yeh, Y.-C., Lee, Y.-H., Liu, H.-w. (2022) Two radical SAM enzymes are necessary and sufficient for the in vitro production of the oxetane nucleoside antiviral agent albucidin, Angew. Chem. Int. Ed. 61, e202210362, 10.1002/anie.202210362. 研究团队介绍 刘鸿文教授，美国德克萨斯大学奥斯汀分校（University of Texas at Austin）自然科学学院化学系以及药学院化学生物学和药物化学系教授。刘教授团队的研究兴趣在于化学和生物学交叉学科的重要科学问题，近年来主要致力于阐明重要天然产物生物合成酶的催化机制，包括生物合成中涉及的自由基转化与碳-碳键生成的详细机制。其团队在国际著名学术杂志发表了多项具有重要影响力的研究成果。 刘鸿文https://www.x-mol.com/university/faculty/361实验室网站https://sites.utexas.edu/liu/ 点击“阅读原文”，查看 化学 • 材料 领域所有收录期刊