近期，美国斯蒂文斯理工学院王红军教授和南开大学朱美峰研究员在Bioactive Materials上联合发表研究文章：通过3D打印聚电解质复合物制作用于组织再生的多孔道生物支架。限制组织工程临床转化的关键因素之一，是无法创建大体积并拥有复杂三维结构的再生组织。在这里研究者通过嵌入式3D打印（EB3DP）聚电解质复合物（PEC）和浇铸的方法，实现了在支架内创建微通道网络。
01
研究内容简介
在体外制造组织工程构建物或在体内进行病变或受损组织的修复时，支架引导的组织再生仍然是主流。通常情况下，由不同材料制成的支架将为贴附细胞创造一个适宜的生长微环境。一般来说，这种支架应具备一个相互连接的孔道网络，孔道具有理想的尺寸、精巧的分层结构和优化的生物学分区。具备孔道的生物支架材料不仅能促进可控的细胞活动（如附着、迁移和分化），并且能在新组织形成期间带来充足的营养供给。越来越多的证据表明，在支架设计中纳入结构的复杂性可以更好地模仿细胞外基质（ECM）的独特机械和生物功能，并在空间中引导形成具有取向性的生物组织，如血管和神经元网络。
因此，本研究打算开发一种广泛适用的方法，探索使用聚电解质复合物（PEC）作为打印墨水，生产制备具有任意形态的可牺牲模板支架，并广泛匹配各种浇铸材料（如聚合物熔体、合成和天然聚合物溶液、热敏水凝胶和光交联水凝胶），通过PEC对外部刺激（如pH值和离子浓度）的敏感解离反应，制造出含有三维分层和任意通道结构的生物支架（图1）。这项研究不仅证明了在生物支架内创建分层通道网络的可能性，而且还提供了一个有效的途径来快速可重复地设计孔道结构，以便在组织工程领域对具有各向异性和复杂性的细胞进行空间引导再生。
图1. 通过3D打印的可牺牲聚电解质复合物（PEC）模板辅助策略，形成具有三维分层、任意构型的多功能孔道支架的关键步骤示意图。
一、可打印的PEC墨水的制备与表征
聚（二烯丙基二甲基氯化铵）（PDADMAC）和聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS）的聚电解质被认为是一个充满潜力的PEC耦合对，它们表现出良好的结合强度、快速的结合速率、对离子强度的敏感性（结合/解离）、对高温的耐受性（高达350℃）、相对较高的硬度（∼10MPa）和可忽略的细胞毒性。如图2A所示，将PDADMAC和PSS以单体单位2.50M的浓度以1:1的体积比混合，通过内在的静电相互作用可以导致快速结合（<1分钟）生成PEC。从理论上讲，许多类型的盐可以用来部分或完全解离PEC，并呈现可调节的粘度。解离速度主要依赖于生成PEC的电解质耦合对的强度、离子扩散系数和盐的解离速度。溴化钾（KBr）在本研究中被特别选择，因为它被证明有能力比氯化钠更快地达到掺杂平衡。如图2B所示，随着KBr浓度的增加，PDADMAC/PSS复合物逐渐被来自PEC "外在位点 "的反离子（即K+和Br-）补偿。在较低的KBr浓度（≤1.50M KBr）下，PEC被塑化，同时保持物理上的完整。当KBr浓度增加到1.75M时，PEC变成了一种粘稠的液体（称为 "共析物"），其粘度适合于挤出打印，不会因为剪切引起的压力下降而堵塞打印喷头（图2C）。随着KBr浓度的进一步增加（≥2.00M KBr），PEC中预耦合的PDADMAC/PSS被KBr离子完全解离，形成一个均匀的溶液。鉴于PEC（PDADMAC/PSS）通过添加水或高浓度KBr可逆的沉淀/溶解机制，它不仅提供了一个可控的方法来调节PEC墨水的粘度以便进行3D打印，而且还提供了一个方便和 "绿色 "的手段来去除和回收作为牺牲模板的PEC支架。如图2D所示，PEC支架可以迅速溶解在2.00M的KBr溶液中，并在降低KBr浓度后重新沉淀。在离心和清洗后，沉淀的PEC可以被收集并重新溶解在1.75M的KBr中，形成可打印的凝聚物，使环保和成本效益达到了平衡。
图2. PEC打印墨水关键参数优化和PEC可牺牲模板的回收过程。A）用于嵌入式3D打印（EB3DP）的PEC墨水的制备示意图。B）不同浓度KBr水溶液中PEC沉淀物溶解的宏观图像。C) 溶解在不同浓度的KBr溶液中的PEC的流变曲线。D) 3D打印的PEC模板的完整回收过程。
二、在Pluronic 127水凝胶中进行嵌入式3D打印制备PEC可牺牲支架
图3. 与制造PEC可牺牲模板有关的关键参数的优化。A）自制的3D打印机和嵌入式3D打印的示意图。B)嵌入式3D打印过程示意图。C）两种浓度的Pluronic F127在室温下的流变特性。D) 三个打印边界条件的示意图。E）在PEC打印纤维的形成过程中，25%（w/v）水溶液中的反离子、水和PEC耦合对的再平衡的示意图阐述。F）Va和Vp的彩色编码图与PEC可打印性。G）1.75M KBr PEC共析物的纤维直径与Vp/Va比值之间的相关性。
图4. 在嵌入式3D打印过程中，PEC微纤维的不同空间构型和相关的机械稳定性。A) 各种纤维直径和纤维间距离的立体显微镜图像。比例尺：a）500μm；b）200μm。B）PEC纤维的SEM显微照片。L-a）从1.75M KBr PEC共析物中打印的纤维的形态（L-b）。从1.75M KBr PEC共析物中提取的直径为L-c)120 μm、L-d)200 μm和L-e)500 μm的PEC纤维的横截面。比例尺：a）200μm；b）50μm；c）20μm；d）50μm；e）100μm。C) 15°到90°不同叠加角度的PEC纤维的立体显微镜图像，复杂的图案和多个叠加层。比例尺：a-i）500μm；j-l）2mm。D) 在干燥条件下的打印PEC可牺牲模板的特征。D-a）干燥的PEC模板。D-b）在循环压缩测试下，干燥的PEC模板的机械稳定性的宏观演示。D-c）干燥的PEC可牺牲模板在第1个（蓝色）和第20个（红色）压缩周期后的应力-应变曲线。E）湿的PEC可牺牲模板的宏观视图（a）没有折叠（b）和折叠（c），以显示结构的完整性。
三、在聚(1, 8-辛二醇-柠檬酸)(POC)铸模内形成微通道网络
图5. 具有不同形貌的多功能孔道网络的POC支架的形成。A）PEC可牺牲模板在POC铸型内形成相互连接的通道网络的示意图。B）在去除PEC可牺牲模板前后，带有微通道的POC铸型的横截面的SEM显微照片。比例尺。100μm。C) 表征POC铸模内相互连接的微通道的渗透性，其中C-a)中说明了实验设置，C-b)中显示了染色溶液（蓝色）通过通道的延时渗透。比例尺：200μm。D) 具有不同通道结构的孔道POC支架的显微图像（a-iii至d-iii）和渗透性（a-iv至d-iv），这些支架是通过将PEC模板（a-i至d-i）从PEC/POC铸模（a-ii至d-ii）中移除而产生的。比例尺：a-b) 200 μm；c-d) 500μm。E）根据Micro-CT扫描的俯视图（a-ii至b-ii）和侧视图（a-iii至b-iii），确认在POC（黄色）内形成与原始设计（a-i至b-i）类似的理想的开放微通道（红色）。
四、利用PEC可牺牲模板在不同的可浇铸材料中形成微通道
图6. 由多功能可铸生物材料形成的通道支架。A）在（a-i&ii至d-i&ii）和（a-iii&iv至d-iii&iv）去除PEC可牺牲模板之前和之后，由琼脂糖（Aa）、甲基丙烯酸明胶（GelMA）（Ab）、胶原蛋白（Ac）和PS（Ad）制备的通道支架的显微镜图像。B）去除PEC后不同材料内的通道收缩量的量化。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不显著）。C) 通道网络的发展与其他致孔方法（如颗粒浸出、冻干、气体发泡）相结合（Ca），形成具有多尺度多孔结构的通道支架，如冻干后的SF（Cb-d）和GelMA（Ce-f）。嵌入SF浇铸材料中的PEC模板的SEM显微照片（Cb-i和ii），以及与没有通道的SF冻干支架（Cd）相比，去除PEC模板后冻干孔隙中形成的微通道（Cc-i和ii）。具有额外冻干孔的通道GelMA支架的SEM显微照片（Ce-i和ii），与没有通道的支架不同（Cf）。比例尺。100 μm。D) 通过Micro-CT扫描确定，带有冻干孔的GelMA和SF微通道支架的孔隙率具有可比性。(n≥5，NS：不显著）。
五、孔道支架的体外组织形成
图7. 小鼠成纤维细胞（STO细胞）在有通道和无通道的SF支架内进行体外培养，以评估其对组织形成的支持性。A）细胞播种和在生物反应器内的连续培养条件的示意图。B) 培养1、7和14天后，STO细胞在支架B和非通道对照内的附着和增殖的定量分析。细胞增殖是通过MTS检测间接测量的。(n≥5，*p＜0.05，NS：不显著）。C）用于创建不同通道支架的PEC可牺牲模板（A，B，C）的形态。 ai-ci）PEC可牺牲模板的SEM显微照片。比例尺：200μm aii-cii) PEC可牺牲模板的立体显微镜图像。比例尺：500μm。表2总结了不同支架的关键属性。D) 培养的生物支架的H&E染色横截面的代表性显微图像，显示了非通道对照（Da）和支架B（Db）在培养1、7和14天后的细胞分布和组织形成。比例尺：200μm。 #：通道的横截面。黑色箭头：细胞和新形成的组织。D) 培养的生物支架Masson's三色染色横截面的代表性显微图像，以更好地显示非通道对照（Ea）支架B（Eb）内新合成的胶原蛋白（蓝色）以及培养7天和14天后的情况。比例尺：200μm。 #：通道的横断面。
六、孔道支架的体内组织再生和血管化
图8. 在体内植入各种有通道和无通道的SF支架以评估微通道对组织生长的影响。A）实验装置的示意图，其中通道支架（支架A、B和C）或非通道支架（对照）被植入大鼠的皮下。B）皮下植入2周（Ba-i至Bd-i）和4周（Ba-ii至Bd-ii）后，外植体的H&E染色截面的代表性显微镜图像。比例尺：200μm。#：通道的横截面。黑色箭头：新形成的组织。黄色箭头：新形成的毛细血管。C）皮下植入2和4周后，不同支架内组织生长的半定量表征。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不显著）。D) 对vWF（绿色）和DAPI（蓝色）进行免疫荧光染色后，新血管形成的外植体截面（Da-i至Dc-i）的代表性荧光图像。炎症性巨噬细胞（Da-ii至Dc-ii）在免疫荧光染色iNOS（红色）和DAPI（蓝色）标记后，以及抗炎性巨噬细胞（Da-iii至Dc-iii）在免疫荧光染色CD206（绿色）和DAPI（蓝色）标记后。比例尺。100 μm。 #：通道的横切面。黄色箭头：新形成的毛细血管。
最后，作者指出，PEC生物墨水和Pluronic F127支持基质在嵌入式3D打印中的优化组合可以确定几个相关的创新，包括1）在高打印分辨率下形成复杂的多层结构，2）相对较低的规模化障碍，以及3）制造过程中强大的容错性。分层通道网络在体外和体内表现出良好的通畅性，能促进质量交换以维持高细胞活力，并在皮下植入后促进组织再生和整合。这样的孔道支架将大大有利于生理相关组织的形成，可以用于体外测试组织模型或体内重建手术。
02
论文第一/通讯作者简介
第一作者：王皓宇
美国斯蒂文斯理工学院生物医学工程系博士后。从事3D打印与组织工程方向研究。
通讯作者：朱美峰
南开大学生命科学学院，特聘研究员。主要研究方向为拓扑结构生物材料设计与构建，干细胞与胰岛移植，活性材料引导原位组织再生，材料与细胞相互作用，药物释放等。
通讯作者：王红军
现任职于美国斯蒂文斯理工学院生物医学工程系教授，并兼职化学与生物化学系教授。其先后于南开大学(获得理学学士、硕士、博士学位)及荷兰德温特大学学习(获生物医学工程博士学位)。毕业后，在美国哈佛医学院从事博士后研究。其课题组侧重于生物仿生材料，组织工程，3D组织重建与再生，以及3D生物打印等方面的研究。近年来先后发表学术论文110余篇，申请发明专利12项，并参与撰写英文书籍及章节10余部。长期担任Advanced Materials、Nature Communication、PNAS、JACS, Biomaterials、ACS Nano 等不同杂志的审稿人。
03
资助信息
这项研究得到了美国国家科学基金会（NSF-DMR奖号1508511）和美国国立卫生研究院奖号1R01AR067859的财政支持。
04
原文信息
Haoyu Wang, Xiaqing Zhou, Juan Wang, Xinping Zhang, Meifeng Zhu*, Hongjun Wang*.
Fabrication of channeled scaffolds through polyelectrolyte complex (PEC) printed sacrificial templates for tissue formation.
Bioactive Materials, 17, (2022) 261-275.
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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。
2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。
位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。
CiteScore 2021: 14.3。