撰文 | Qi

Type VI CRISPR-Cas系统利用RNA引导的核糖核酸酶Cas13（C2c2）来保护细菌免受病毒侵害。最近的研究发现在细菌在受到MS2单链RNA (ssRNA) 噬菌体攻击时，两个辅助基因csx27和csx28能调节特定的含有Cas13b的CRISPR系统 (VI-B型) 的抗噬菌体防御活性，而其编码蛋白已被隐马尔可夫模型预测到含有跨膜结构域。此外，还预测到Csx28可能包含可能发挥核糖核酸酶活性的高等真核和原核核苷酸结合 (HEPN) 基序【1, 2】，但这些特征间的相关性以及它们在Cas13介导的防御中的作用尚不清楚。

为此，来自美国罗彻斯特大学的Mitchell R. O’Connell团队在Science杂志上发表了一篇题为 Csx28 is a membrane pore that enhances CRISPR-Cas13b–dependent antiphage defense 的文章，他们证明Csx28是一种跨膜蛋白，有助于在病毒感染后减缓细胞代谢，增强抗病毒防御。高分辨率冷冻电子显微镜显示Csx28形成八聚体孔状结构，定位于内膜。Csx28在体内的抗病毒活性需要Cas13b对病毒mRNA进行序列特异性切割，随后导致膜去极化、减慢新陈代谢并抑制持续的病毒感染。总之，这项工作提出了一种机制，即Csx28作为下游的Cas13b依赖性效应蛋白，利用膜扰动进行抗病毒防御。

研究人员利用噬菌体干扰系统以了解Csx28如何促进抗噬菌体防御，在Cas13b-crRNA-1和Cas13-crRNA-2对噬菌体感染提供适度保护的基础上，Csx28的存在进一步增强了两者介导的抗噬菌体活性。为了确定Csx28的作用方式，研究人员依次通过ECOI测定和噬菌体积累测定发现，如果将Csx28添加到Cas13b:crRNA-1培养物中可以将噬菌体的释放从18.5%减少到仅约3%的感染细胞，提示Csx28可以通过限制最初感染细胞释放噬菌体后代的数量来增强Cas13b防御。此外，还观察到与未转化的大肠杆菌或仅包含Cas13b的宿主相比， Csx28的存在可以显著减少每毫升培养物中的噬菌体数量。

接下来，作者从大肠杆菌中表达并纯化了重组Csx28，基于该蛋白的溶解性质判断它可能在体内与膜相关。尺寸排阻色谱 (SEC) 结合静态光散射(SECSLS)表明，Csx28可能形成了八聚体复合物，cryo-EM进一步证实其形成独特的具有对称性的同源八聚体孔状结构，中心孔直径约为10Å，孔内衬有大部分带正电荷的氨基酸侧链，这些带正电的区域可以提供对特定离子或代谢物的选择性，或充当潜在的核酸结合位点，之前的工作预测该蛋白存在HEPN基序，这里确认了这一点，且其中的精氨酸R152对于RNA水解而言通常所必需的，还与来自同一单蛋白中的E122形成盐桥。为了确认这一八聚体结构对噬菌体防御活动的影响，作者产生了一系列Csx28单个蛋白之间界面上的点突变，发现该区域的单点突变导致λ噬菌体防御能力降低约2至1400倍，且双点突变会进一步加剧这种效应。此外，如果通过点突变破坏R152和E122形成的盐桥则会导致Csx28介导的λ噬菌体防御功能丧失。

图. Cryo-EM显示Csx28形成一种八聚体孔状结构。

鉴于在cryo-EM分析中观察到的孔状结构，作者想知道Csx28如何影响体内膜功能。分别使用标记后的HA-Cas13b和Csx28-V5进行蛋白质印迹实验发现HA-Cas13b与胞质溶胶中的DnaK（一种胞质伴侣蛋白）共分级，而Csx28-V5仅存在于DDM可溶性膜组分中，与OmpC（一种外膜孔蛋白）共分级。进一步对内/外膜进行额外分级确认无论有无λ噬菌体感染，Csx28-V5均定位于内膜中。随后，作者进行了基于流式细胞术的膜去极化测定，只有噬菌体感染的同时包含Cas13b:crRNA-1和Csx28的菌株出现明显的膜去极化，单独表达Cas13b:crRNA-1、Csx28或Cas13b:ΔcrRNA的则不会出现膜去极化的显著增加。为了进一步探索膜去极化的下游效应，作者进行了刃天青测定以测试Csx28介导的膜去极化是否影响细胞代谢【3】。含有Cas13b:crRNA-1:Csx28的培养物表现出明显不同的刃天青转换动力学，两个阶段的转换速度明显较慢，这表明新陈代谢率降低。

那么噬菌体RNA的Cas13b感应如何与Csx28通信以调节其在内膜的功能呢？通过RNA凝胶迁移实验，作者观察到八聚体而非单体Csx28能够以高亲和力结合RNA，且交联实验表明RNA结合最有可能发生在Csx28单体-单体交界面上。作者想知道Csx28本身是否具有RNase活性或是否能增强Cas13b RNase活性，于是通过体外实验，发现纯化的Cas13b:crRNA在与靶RNA结合时对荧光RNA报告基因具有强大的裂解能力，但单体或八聚体Csx28都不能裂解RNA报告基因或提高Cas13b的RNase活性。为了验证另一种假设，即Csx28的膜调节活性是与活性Cas13b:crRNA直接结合相互作用的结果，作者在有无λ噬菌体感染的情况下进行了HA-Cas13:crRNA1和Csx28- v5免疫沉淀，以及纯化的Cas13b复合物和八聚体Csx28的尺寸排阻实验，在所有情况下都无法检测到活性Cas13b:crRNA:target-RNA复合物与Csx28之间的直接相互作用。

综上所述，Csx28并不像之前假设的那样可以增强Cas13b的RNase活性，而是在抗噬菌体防御中充当末端效应器，即在感染过程中Cas13-crRNA引导噬菌体mRNA的切割，而Csx28的膜包埋的八聚体孔状结构促进膜去极化并减缓细胞代谢，这种活动能显着增加抗病毒防御。总之，这项工作指出细菌通过CRISPR-Cas蛋白协同膜扰动限制噬菌体增殖的防御机制。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abm1184

制版人：十一

1. A. A. Smargon et al., Mol. Cell 65, 618–630.e7 (2017).

2. S. Shmakov et al., Nat. Rev. Microbiol. 15, 169–182 (2017).

3. O. Braissant, M. Astasov-Frauenhoffer, T. Waltimo, G. Bonkat, Front. Microbiol. 11, 547458 (2020).