■ 导读

蒋宝鑫等为分离比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)的F3H基因，首先对F3H蛋白序列的同源性进行比对分析，并利用简并引物扩增出保守区序列，随后通过cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术将这一保守序列向两端延伸，最终获得全长1 245 bp的cDNA序列。他们还对克隆的F3H基因分别进行功能位点预测、表达模式检测和异位表达功能验证，为杜鹃花花色的分子机理研究奠定基础。

摘要：黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)是植物花青素(anthocyanin)合成过程中的关键酶。本研究以红色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同发育时期的花瓣为实验材料，利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术对比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶(Rhododendron hybridum Hort. flavanone 3-hydroxylase, RhF3H)基因进行克隆，并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR技术对不同发育时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析；构建pET-28a-RhF3H原核表达载体对RhF3H蛋白进行制备和纯化；构建pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体，通过农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究。结果表明，比利时杜鹃花RhF3H基因全长为1 245 bp，开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 092 bp，编码363个氨基酸，含有Fe²⁺结合基序和2-酮戊二酸结合基序的双加氧酶超家族。系统进化分析表明，比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近；实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析表明，在不同发育时期花瓣中，红色比利时杜鹃花RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势，在初开期表达量最高；原核表达结果表明，构建原核表达载体pET-28a-RhF3H诱导蛋白大小约为40 kDa，与理论值相近；成功获得转基因RhF3H拟南芥植株，PCR鉴定和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)染色证明RhF3H基因整合到拟南芥植株基因组中。qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析显示，相对于野生型，RhF3H在转基因拟南芥植株中显著高表达，其总黄酮和花青素含量也显著增加。本研究为探究杜鹃花RhF3H基因功能提供一定的理论基础，对杜鹃花花色的分子机理有重要的研究价值。

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