撰文 | 言笑

分泌蛋白，如细胞因子、趋化因子、细胞毒性分子和生长因子，在生理和病理条件下介导细胞间通讯和功能塑造方面起着至关重要的作用。在过去的十年中，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和多参数流式细胞术 （multiparameter flow cytometry）的发展极大地促进了人们对细胞异质性的理解。尽管如此，由于当前单细胞多组学分析技术的技术瓶颈，功能蛋白释放与细胞表型及转录特征之间的相关性仍然不确定。虽然一些分泌蛋白在其基因转录后便可立即被翻译和释放出胞外，但其他一些分泌蛋白（如巨噬细胞中的TNF）的释放却是在转录和翻译水平甚至是翻译后的修饰过程受到严格调节的。此外，相同的蛋白质在不同的细胞中也可使用不同的分泌途径。在粒细胞中，许多细胞因子储存在分泌颗粒中，并在刺激时迅速释放【1】。效应因子颗粒酶（granzyme B）GrB及穿孔素（perforin）也可预储存在细胞毒性T细胞 （CTL）和自然杀伤细胞（NK）的颗粒中，以便在细胞介导的细胞毒性期间释放【2】。因此，测量单细胞的实际蛋白分泌能力而不是其在胞内的聚集水平或相应基因的转录本 （mRNA）丰度对于了解细胞功能的异质性非常重要。

当前，一些广泛使用的细胞蛋白分泌检测方法（比如酶联免疫吸附测定（ELISA）和Luminex多因子检测技术）主要是通过测量细胞外的释放物来评估细胞群体的蛋白质分泌能力，而无法提供有关产生这些分泌蛋白的源细胞的信息。另一方面，也有基于流式细胞技术的测定方法，如分泌物捕获测定（secretion capture assay, SCA），它使用亲和基质将分泌物捕获到细胞表面，已用于表征分泌细胞因子的T细胞和表达抗体的B细胞【3-5】。细胞内细胞因子染色（Intracellular cytokine staining, ICS）测定也可以评估单细胞蛋白表达，但不能区分细胞内储存的蛋白质和分泌的蛋白质，并且需要人为阻断分泌途径以积累细胞内的分泌蛋白。由于荧光光谱重叠，这些基于流式细胞术的蛋白质分泌测定也受到可同时检测的靶标数量的限制。因此，开发能够以单细胞分辨率同时测量多个细胞特征（如蛋白质分泌、表型和转录谱）并最终能够获得单细胞蛋白质动态分泌 （时间维度）的的方法，不仅对细胞生物学和病理学的基础研究很重要，对疾病治疗方案的合理设计也将有深远的意义。

近日，来自新加坡国立大学的Lih Feng Cheow团队（第一作者为吴同金）在Nature Methods杂志上在线发表了题为Time-resolved assessment of single-cell protein secretion by sequencing的方法文章。作者开发了一种新方法TRAPS-seq（time-resolved assessment of protein secretion from single cells by sequencing）：通过TRAPS-seq不仅可以对单细胞蛋白质的分泌进行时间分辨率评估，还能够在单细胞水平上同时测量分泌的蛋白质、细胞表面表型标记和转录组。TRAPS-seq揭示了功能性T细胞的多效性T_H1细胞因子（IFNγ、IL-2和TNF）的分泌特征及其相应的表型和转录决定因素。此外，使用TRAPS-seq可以动态测量单细胞中细胞因子分泌随时间的变化，揭示了控制单细胞细胞因子分泌动力学的独特分子特征。

TRAPS-seq原理及流程：为了追踪分泌蛋白的源细胞， TRAPS-seq首先依赖于细胞膜锚定的亲和基质，这样便可以将分泌的靶蛋白捕获到其自身的细胞表面（图1a）。CD45是一种丰富的白细胞膜蛋白，可用于锚定捕获抗体（CapAbs），将分泌的蛋白质拴在细胞表面。CapAbs修饰的细胞能够灵敏准确地捕获从各个细胞分泌的细胞因子。TRAPS-seq使用了寡核苷酸条形码标记的检测抗体（Ab-oligo）（图1b），可以轻松集成到单细胞多组学研究的高通量平台中，从而实现更高通量的多重检测。虽然分泌物的捕获可以简单地在试管中进行（图1c），但它也与微雕刻阵列中区室化的环境（microengrafted array）兼容（图1d）。微雕刻阵列可以保护T细胞在实验过程中免受扰动，确保通过细胞表面接触的刺激（例如，T细胞与抗原呈递细胞或抗体包被的磁珠的相互作用）得以维持。捕获分泌蛋白后，立即用测序兼容Ab-Oligo标记细胞，靶向表面结合的分泌蛋白和细胞表面标志物（图1a）。随后通过高通量单细胞测序对单细胞转录组、分泌蛋白和表型进行综合分析（图1e）。

图1. TRAPS-seq工作流程示意图

TRAPS-seq 可实现多模态单细胞表征：T_H1 细胞因子（如 IFNγ、IL-2 和 TNF）是协调抗原特异性免疫应答的关键因子。然而，在时间和强度方面，我们仍然缺乏对它们的分泌模式的理解，以及潜在的相关细胞或分子特征。为了解决这些问题，作者使用TRAPS-seq探究了抗CD3/CD28微珠活化（1h、6h和16h）的人淋巴细胞的细胞因子分泌情况（图2）。实验结果显示活化的T细胞确实呈现出细胞因子分泌的多样化模式。（1）细胞因子的蛋白质分泌和基因表达在时间和强度方面存在差异：细胞因子mRNA的表达在早期活化（0-1h）分泌蛋白之前；对于长期活化（6-16h），分泌TNF或IFNγ的细胞比例和基因表达水平随时间增加；IL-2 mRNA表达细胞的百分比增加，但IL-2分泌细胞的百分比保持相对稳定。（2）三种细胞因子的分泌水平和动力学不同：TNF和IL-2的分泌在细胞活化后比IFNγ更早发生。每个细胞的TNF和IL-2的相对分泌在初始刺激（1-6h）下增加，但在晚期激活阶段（6-16h）减少，而每个细胞的相对IFNγ分泌逐渐增加。（3）TRAPS-seq允许细胞因子分泌与单细胞水平的分子参数（如细胞表型和转录组）直接关联：作者根据表面蛋白表达将T淋巴细胞和NK细胞分为11个亚群，并根据其表面蛋白水平和RNA表达对这些亚群进行注释。不同细胞类型在不同时间点的细胞因子mRNA表达和分泌蛋白的比例和组合存在显着差异，表明免疫细胞在功能性细胞因子分泌的不均一性。

图2. TRAPS-seq分析活化后的人淋巴细胞在不同时间点的细胞因子分泌情况

细胞因子分泌模式的转录特征：接下来，作者表征了与T细胞中特定细胞因子分泌模式相关的转录特征。与早期免疫细胞活化相关的基因（FOS、EGR1和CD69）在分泌TNF单阳性或IL-2/TNF双阳性细胞因子的细胞中往往更富集。分泌IFNγ的细胞与不分泌这种细胞因子的细胞之间存在明显的区别，表现为IFNG、趋化因子配体（CCL4、CCL3、CCL4L2、XCL1、XCL2和CCL5）和细胞毒性分子（GZMB和NKG7）的基因上调，表明它们具有很强的效应功能。与分泌IFNγ或IFNγ/TNF双阳性细胞因子的细胞相比，分泌三重细胞因子的细胞中多功能调节细胞因子（IL2、IL21和LTA）的mRNA上调。与分泌IFNγ或IFNγ/TNF双阳性细胞因子的基因相比，具有负共调节功能的CD200和SDC4等基因在这些三重细胞因子分泌T细胞中也上调。与单独分泌IL-2/TNF或TNF的T细胞相比，三阳性细胞也具有明显的转录调节因子编码基因特征，特别是EOMES、BATF3和ZBED2的增加以及IRF1和JUN的减少（图4e），提示了有利于T细胞效应功能形成的基因表达特征。

细胞因子分泌动力学：为了能够综合测量细胞因子分泌动力学与细胞表型和转录组，作者进一步提升了TRAPS-seq的实用性，即以不同荧光修饰的检测抗体区分不同时间分泌的细胞因子。通过该方法能够在两个时间段内同时对三种细胞因子进行多重测量。作者发现即使在刺激16h后，仍可观察到细胞因子分泌模式的多样性。有趣的是，连续时间段内细胞因子分泌模式的转变非常一致。随后，作者探究了初始细胞因子分泌模式与向其他分泌状态动态转变之间的关系，发现细胞因子的初始分泌量是细胞转变为另一种分泌状态的主要决定因素。大量分泌任何两种细胞因子（双阳性）的细胞可以转变为三阳性细胞因子效应细胞，而初始分泌较弱的双阳性细胞因子细胞将在随后的时期保持为双阳性细胞或成为单功能细胞。这些结果表明活化的T细胞之间存在分级反应，其中分泌强度和多功能性密不可分。

细胞因子分泌动力学的分子相关性：作者将寡核苷酸偶联抗体的序列标记与 TRAPS-seq 相结合，以实现细胞因子分泌动力学、细胞表型和转录组的多组学分析。如图 3 所示，用抗CD3/CD28 Dynabeads激活T细胞10h，并在两个连续45分钟的时间窗口内进行TRAPS-seq。数据显示，在比较单细胞细胞因子分泌恢复到基态的概率时，TNF丢失得最快，其次是IFNγ，最后是IL-2。当分析分泌示踪TRAPS-seq结果时，作者确实观察到三重阳性到IFNγ/IL-2，IFNγ/IL-2到IL-2和IL-2到非分泌的最可能中间态转变过程。作者定义了十种主要的动态细胞因子分泌模式，可以概括为三组：（1）维持三阳性细胞因子分泌；（2）涉及IFNγ的其他细胞因子状态转换；（3）不涉及IFNγ的细胞因子状态转换。当考虑共享特定细胞因子转变动态的细胞的转录特征时，作者观察到具有2组动态的细胞比具有1组动态的细胞有更高的细胞毒分子基因表达（PRF1、GZMB、NKG7和GNLY），表明这些细胞中的细胞因子分泌和细胞毒性功能不一致。第3组细胞产生IFNγ参与效应细胞因子的能力相对较差，这与它们的次优活化状态相关，这些激活状态的特征是TNFRSF9、CRTAM和CD44表达较低，但TXNIP水平较高。

图3. 利用TRAPS-seq进行分泌物示踪的实验设计

综上所述，该研究表明，免疫细胞的细胞因子分泌可以是动态和多样化的，只有通过单细胞细胞因子分泌测量才能揭示。TRAPS-seq可用于直接测量分泌蛋白，并可能用于揭示分泌因子的转录后和翻译后调控。与其他方法不同，TRAPS-seq在测量细胞动态蛋白质分泌的能力方面是独一无二的。因此，TRAPS-seq将成为理解细胞功能状态转变过程的宝贵工具。此外，TRAPS-seq 的实用性可以扩展到任何适用于SCA的测量，相同的原理也可以应用于其他蛋白质或细胞类型。当然，通过TRAPS-seq测量的分泌动力学的时间分辨率也存在一定的局限性：（1）由于每个时间窗口内检测抗体结合孵育需要一定时间，TRAPS-seq目前不适合分析需要非常高时间分辨率的快速分泌事件（如在几秒钟内发生的神经递质释放动力学）；（2）由于需要获得一对针对不同表位的捕获和检测抗体，因此实施TRAPS-seq来分析小分子的分泌将具有挑战性。

原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41592-023-01841-y

制版人：十一

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