英文原题：Targeted Protein Degradation through E2 Recruitment
供稿人：杨振霖 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.的文章“Targeted Protein Degradation through E2 Recruitment” 这篇文章来自于加州伯克利分校的Daniel K. Nomura课题组，在这篇文章中，作者使用了高通量的筛选方法，筛选得到了E2酶的一种共价连接剂，并最终构建了降解BRD4以及AR两种靶点的PROTAC，取得了良好的成效。
PROTAC是一种针对于不可成药靶点的强有力的药物模式，能够对很多没有常规手段无法阻断或者靶向的蛋白质进行靶向降解，但是，现在几乎所有的PROTAC都是依赖于E3 ligase，对泛素-蛋白酶体的其他元件的开发依然不够深入，最近研究者们发现，其他元件诸如E2也一样可以驱动降解，作者前面的工作中就发现了EN450可以识别UBE2D从而驱动降解。在这个工作中，作者继续对泛素-蛋白酶体系统的其他元件驱动降解的现象进行了更加深入的探究。
作者首先应用高通量的方法，对E2酶UBE2D2的C85S突变体进行了小分子共价招募剂筛选，筛选得到了EN67作为一种高效的抑制剂（如图1B所示）。作者接下来针对EN67和UBE2D2进行了剂量依赖的交联实验，显示了小分子对酶的强效结合。之后，作者验证了就算结合EN87，也不会影响E2酶UBE2D2的功能（如图1C），之后作者使用LC-MS/MS的方法验证了EN87在E2酶UBE2D2的结合位点是111号位的半胱氨酸（如图1D所示）。到此为止，作者完成了招募子的分子层面的验证以及共价位点鉴定实验。
图1. (A)对能够结合E2的小分子筛选 (B)EN67的结构以及剂量依赖实验 (C) EN67对E2的结合不影响E2的功能 (D) 质谱鉴定EN67与UBE2D2的结合位点
接下来，作者试图确认在整个细胞中EN87的参与度以及对于UBE2D2的选择性，所以作者对于EN67进行了优化，利用有机化学的合成手段，相继合成了四种不同的炔基化衍生物（如图2A所示），并且与UBE2D2进行了剂量依赖的反应，四种衍生物都展现出了非常不错的反应效率，其中以NF363C作为最佳的招募剂被用于后续的PROTAC的构建（如图B所示），从图中可以看出，在50uM的条件下，可以发生较为彻底的反应，这样做也是为了模拟后面的PROTAC分子构建的真实情况。接下来，为了验证NF363C在细胞中的真实捕捉UBE2D2的情况，作者在细胞中通过pull-down的实验，证明NF363C可以实现在细胞中和UBE2D2的结合，最后，为了评估蛋白质组范围的选择性，以及半胱氨酸的反应性和UBE2D2的选择性，作者采用isoDTB-ABPP的方法，显示只有11个靶点的修饰肽的比率大于1.3, 而且其他的靶点都不属于泛素-蛋白酶体通路的蛋白质，这证明了EN67在整个泛素蛋白酶体降解系统中的唯一性（如图D所示）。
图2. (A)一系列炔基EN67衍生物探针的合成 (B)炔基探针的反应性 （C）pull down实验，证明NF363C在活细胞中对于UBE2D2的结合和标记 (D)isoDTB-ABPP手段，证明了EN67对UBE2D2标记的特异性
在进行了上述的EN67细胞层面的验证以及linker的筛选优化之后，作者分别构建了两种PROTAC，第一种PROTAC是BRD4的降解剂，作者合成了NF90作为BRD4的降解剂（如图3A所示），并继续验证了PROTAC的反应性与降解能力，从图3的C图中可以看出，short BRD4出现了非常明显的降解现象，这证明了基于E2酶构建的PROTAC的可行性，同时，作者进行了机理的探究实验（如图3E所示）。当加入了BTZ作为蛋白酶体抑制剂的时候，可以观察到降解的减弱，当加入Neddylation抑制剂的时候，也可以观察到降解现象的减弱，这些现象共同表明了降解途径是经过E2的蛋白酶体降解。
图3.(A) 降解BRD4的PROTAC的结构 (B)与UBE2D2的剂量依赖反应 (C)（D）NF90降解BRD4的浓度依赖实验 (E) 降解机理研究实验 (F) UBE2D2家族敲除实验
最后，作者换了另外一个靶点（AR）雄激素受体，构建了NF500C作为AR雄激素受体的降解PROTAC，之后模仿之前的实验，对雄激素受体这个靶点进行了浓度梯度实验以及抑制剂实验，同样也证明了E2策略在雄激素受体上的成功应用，如图4所示，同时作者做了定量蛋白质组学，证明了雄激素受体被降解的特异性和唯一性。
图4. (A)雄激素受体的binding分子以及构建的PROTAC降解分子 (B) NF500C对AR的浓度依赖实验 （C）加入抑制剂的机理研究实验 (D) 定量蛋白质组学质谱探究证明降解靶点的特异性
综上所述，作者发展了一系列基于E2 的PROTAC，利用筛选的手段筛选到了E2的共价结合小分子，并且成功利用了这个小分子构建出了降解BRD4以及AR的PROTAC，在质谱，western blot多个层面表征了降解的特异性和唯一性，并且证明了通过E2的蛋白酶体降解通路。
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ACS Chem. Biol. 2023, ASAP
Publication Date: March 20, 2023
https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00040
Copyright © 2023 American Chemical Society
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