在自然界中，生物体通过利用有机基质来精确调控无机矿物的形成，这被称为生物矿化这些有机-无机杂化生物矿物是生物有机体和无机材料之间的桥梁，在生命过程中发挥着至关重要的作用。一方面，生物矿物质是为生物体提供保护(如贝壳)、支持(如骨骼)和工具(如牙齿)的基本成分。另一方面，关节软骨、心血管组织和肾脏等软组织的异常病理性矿化会导致发病甚至死亡。有趣的是，在特定类型的肿瘤化疗或放疗后也观察到异位矿化，已被证明在一定程度上与良性预后相关。因此，尽管存在相关的挑战，但使用化学工具有意地诱导仿生矿物形成以程序化方式抑制肿瘤生长仍具有很大的前景。
基于此，长春应化所陈学思院士和丁建勋研究员合作开发了一种用于骨肉瘤阻断治疗的生物矿化诱导纳米颗粒(BINP)。BINP由十二胺聚[(γ-十二烷基-l-谷氨酸)-共-(l-组氨酸)]-嵌段-聚(l-谷氨酸移植物-阿仑膦酸盐)组成，并结合了细胞膜插入部分、肿瘤微环境(TME)反应成分和离子螯合基序（示意图1）。将BINP静脉注射到骨肉瘤荷瘤小鼠体内后，经酸性TME暴露扩张后的纳米颗粒表面的十二烷基基团，促进其膜插入。随后，突出的双膦酸基团引发持续离子沉积，在肿瘤周围构建矿化屏障，阻断肿瘤与周围正常组织之间的物质交换。与Control组相比，BINP介导的阻断治疗对皮下和原位骨肉瘤的肿瘤抑制率分别为59.3%和52.1%。此外，阿仑膦酸盐部分对破骨细胞的抑制减轻了骨溶解，进一步抑制了肺转移。因此，BINP启动的选择性生物矿化为骨肉瘤的临床治疗提供了一种有前景的选择。相关工作以“Acidity-Triggered Transformable Polypeptide Self-Assembly to Initiate Tumor-Specific Biomineralization”发表在《Advanced Materials》。示意图1. TME反应性BINP对骨肉瘤进展的抑制作用BINP启动肿瘤组织周围的生物矿物沉积，并减轻由过度活跃的破骨细胞介导的骨破坏
比较三种不同pH值下BINP在氧化氘中记录的1H NMR谱进一步证明了其对酸的响应性。如图1A所示，与pH值7.4时相比，pH值6.5或5.5时峰D、C和B的积分增加，峰A的积分保持不变。B、C、D峰的积分随着溶液酸度的增加而增加。如图1B所示，这可能是由于在酸性条件下，扩张后的BINP表面有更多的脂肪链和咪唑环暴露，这些脂肪链和咪唑环最初在pH 7.4时位于胶束核心内。相比之下，在pH 7.4、6.5或5.5的氧化氘中，DDA-P(DLG-co-LP)-b-P(LG-g-ALN)的三个1H NMR波谱均显示出脂肪链(B)和芳香族环(C)中的质子由于胶束形成的微弱共振信号。此外，无论pH值如何，B和C峰的积分保持不变，表明纳米结构不依赖于pH值。为了全面表征转化过程，我们测定了不同pH值下BINP的大小、形态和zeta电位(图1C,D)。动态光散射(DLS)结果显示，当溶液pH分别由7.4降至6.5和5.5时，BINP的粒径分别由88.0±0.8增加至277.7±7.2和324.2±7.4 nm。插图根据DLS结果显示相应的透射电子显微镜(TEM)图像。正如预期的那样，随着pH值的降低，BINP的zeta电位从−40.03±1.04增加到−31.63±1.26和−22.23±0.64 mV。此外，加入Ca2+后增加的zeta电位表明了双膦酸盐和Ca2+之间的相互作用。因此，在正常生理条件下，P(DLG-co-LH)-b-P(LG-g-ALN)倾向于自组装成纳米胶束，即BINP，而在微酸性环境下，这一过程受到干扰，导致内部脂肪链暴露。BINP的细胞膜插入和体外生物矿化诱导及矿化对细胞性质的影响肿瘤细胞周围由BINP启动的生物矿化壳的生成可分为四个步骤:BINP的酸性响应性膨胀、细胞膜插入诱导的变形、细胞膜上的离子沉积和生物矿化，如图2A所示。合成异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的BINP (F-BINP)，观察不同pH值下BINP在细胞膜黏附的差异。我们选择人骨肉瘤细胞系作为概念验证。以生理盐水培养的143B细胞作为对照组，F-BINP处理pH值为7.4和6.5的细胞组分别称为F-BINP-7.4和F-BINP-6.5。激光共聚焦显微镜(CLSM)观察到，F-BINP(绿色)的荧光信号与细胞膜(红色)共定位良好，证明了BINP易于插入细胞膜(图2B,C)。z -堆栈图像也证实了这一空间共定位。在培养过程中，只有少量的BINP内化于细胞质中。流式细胞术检测BINP的黏附能力。如图2D (F-BINP-7.4组)和2E (F-BINP-6.5组)所示，随着孵育时间从1到3 h的延长，143B细胞的荧光强度逐渐增加。根据CLSM结果，平均荧光强度(MFI)在酸性培养基中比在中性培养基中更显著，这可能与pH 6.5时脂肪链暴露增加有关(图2F)。为了区分细胞膜结合型和胞吞型BINP，我们使用了一种细胞膜不渗透的FITC猝灭剂锥虫蓝(TB)猝灭细胞外F-BINP发出的荧光。TB处理后，与F-BINP在pH 6.5条件下共培养1、2、3 h的143B细胞MFI值分别降低了88.7%、79.2%、64.2%，大于F-BINP-7.4组的相应值80.8%、67.7%、52.5%。因此，酸性条件有利于将聚合物固定在细胞膜上，减少胞吞作用。此外，至少在短的潜伏期内，大多数BINP倾向于插入细胞膜而不是进入癌细胞。图2. BINP的细胞膜插入和体外生物矿化诱导及矿化对细胞性质的影响这有利于BINP的粒径增大、脂肪链暴露及后续膜插入，有利于BINP的长时间滞留。为了说明这一点，研究者合成了Cy5.5标记的BINP (CyBINP)来监测其在体内的生物分布。将Cy-BINP注射到BALB/c小鼠皮下骨肉瘤移植瘤中。如图3A所示，cyBINP注射后1 h，肿瘤区域(红色圆圈所示)才出现明亮的荧光信号。注射后12 h累积量达到峰值，在靶区滞留时间长达2天(图3B)。另外，静脉注射Cy-BINP后12 h分离肿瘤组织，制备冰冻切片。Cy5.5(红色)和钙黄绿素(绿色)的荧光信号共定位反映了Cy-BINP主要分布在肿瘤组织的边缘，并诱导Ca沉积。相比之下，在对照组的切片中，钙黄绿素信号可以忽略不计。因此，BINP能够在肿瘤部位迅速富集，响应酸性微环境暴露其脂肪链，然后插入肿瘤细胞膜实现长时间滞留。随后，BINP的双膦酸基团支持矿物质沉积，最终在肿瘤周围建立了一个物理外壳。受到这些结果的鼓舞，研究者在BALB/c小鼠皮下K7M2同种异体移植物中使用BINP来评估其抗肿瘤能力。当肿瘤体积达到约70 mm3时，将小鼠随机分为三组，每隔一天尾静脉注射200.0µL的生理盐水或含有10.0或15.0 mg mL-1BINP的生理盐水，分别称为Control、BINP-10和BINP-15组(图3C)。如图3D所示，Control组小鼠的肿瘤生长迅速。与之形成鲜明对比的是，BINP可有效抑制肿瘤生长(图3E)。与Control组相比，BINP-10组和BINP-15组的抑瘤率分别为37.6%和59.3%。图3. BINP诱导的生物矿化抑制异体皮下骨肉瘤的生长然后，观察BINP在荷瘤裸鼠体内的分布。如图4A所示，由于ALN的骨靶向特性和EPR效应，Cy-BINP在3小时内到达肿瘤病灶。与皮下模型一致，注射后12 h原位肿瘤部位Cy-BINP累积浓度达峰值。此外，Cy-BINP在肿瘤部位停留长达48小时，作为矿化诱导剂发挥作用，从而支持生物屏障的逐步形成。鉴于高剂量BINP单药治疗的小鼠在原位骨肉瘤模型中表现出中度的肿瘤抑制效果，我们尝试将BINP与化疗药物联合用于原位143B骨肉瘤治疗。替雷帕嗪(TPZ)作为一种代表性的缺氧激活前药，在缺氧条件下经过单电子还原反应和脱水后转化为苯并三嗪基(BTZ)。通过与细胞内DNA的相互作用，BTZ自由基在癌细胞系中表现出比其前体高300倍的毒性当原位肿瘤体积达到约200 mm3时，将BALB/c裸鼠随机分为4组，分别注射生理盐水、TPZ、BINP或BINP和TPZ的组合，分别称为Control组、TPZ组、BINP组和BINP+TPZ组(图4C)。TPZ腹腔内给药剂量为40.0 mg / kg体重(mg (kg WT) -1)， BINP静脉内给药剂量为3.0 mg /只小鼠。如图4D，E所示，由于骨肉瘤恶性程度高，Control组肿瘤进展迅速，第19天肿瘤体积均超过2 cm3。因此，出于伦理考虑，生存试验必须在第19日终止。TPZ的抑瘤作用有限，抑瘤率为32.3%。此外，TPZ组小鼠在治疗开始后第28天因伦理原因被实施安乐死。与单用BINP相比，联合TPZ具有明显的协同作用，抑瘤率(71.0%)显著高于单用BINP(52.1%)。值得注意的是，在40 d的实验期间，BINP和TPZ联合治疗的小鼠均未死亡。图4. BINP诱导生物矿化对异种骨肉瘤生长的抑制作用TME中骨肉瘤细胞与破骨细胞之间存在恶性循环，骨肉瘤细胞产生核因子κB受体活化因子配体(RANKL)激活破骨细胞前体，导致骨基质降解。反过来，骨破坏过程中会释放骨源性生长因子(如转化生长因子-β)，促进骨肉瘤的进展。值得注意的是，含氮的双膦酸盐是一种抗破骨细胞的药物，它可以阻止GTP酶的异戊基化，从而抵消破骨细胞的过度激活，减轻原发肿瘤病灶的骨破坏，从而断开其与骨肉瘤细胞的连接。因此，除了具有离子富集能力外，ALN在BINP中的抗骨溶解能力可能有利于抑制肿瘤生长和肺转移。为了验证BINP在细胞水平上对破骨细胞形成的抑制作用，将RAW 264.7细胞用生理盐水和50.0 ng mL−1 RANKL孵育，诱导RAW 264.7细胞向破骨细胞分化(对照组)。在BINP-7.4组和BINP-6.5组中，在pH值为7.4或6.5的培养基中添加0.1 mg mL−1的BINP。7 d后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒检测破骨细胞水平。如图5A所示，与Control组相比，BINP-7.4组和BINP-6.5组的TRAP活性分别下降了44.5%和63.6%，表明BINP阻碍了RANKl诱导的破骨细胞分化。Micro-CT扫描评估小鼠右下肢骨质破坏程度。图5B显示了Control和TPZ组的胫骨平台区域严重缺损，而BINP和BINP+TPZ组的这些区域相对完整。以胫骨平台为感兴趣区(ROI)进行比较，使用CTAn软件评估骨相关参数。与Control组相比，BINP组和BINP+TPZ组ROI的骨体积(bone volume, BV)和骨体积与总体积的比值(bone volume to total volume, BV/TV)分别增加了2.7倍和3.3倍(图5C,D)。此外，BINP的应用保持了骨小梁和皮质骨的完整性，增加了骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)(图5E,F)。因此，BINP有效地减轻了与侵袭性骨肉瘤相关的骨破坏，从而进一步抑制了原发性骨肉瘤的生长和肺转移播散。研究者成功地开发了一种酸敏感的用于骨肉瘤生物矿化治疗的纳米平台。制备的BINP由三个关键的功能成分组成，即细胞膜插入部分，TME响应部分和离子吸引基序。全身给药后，由于ALN的主动靶向性和EPR效应，BINP在肿瘤部位聚集。在酸性TME中，BINP纳米结构变得不稳定，并暴露其长脂肪链，插入细胞膜。随后，细胞表面的双膦酸基团启动了矿化链反应，最终建立了物理屏障。因此，BINP抑制了皮下和原位骨肉瘤的进展，并且可以忽略全身毒性。此外，基于BINP的阻断治疗有效地减少了肿瘤区域的血供，引发了肿瘤区域的缺氧加重。因此，结合BINP和缺氧激活的TPZ表现出显著的肿瘤抑制效果，并在原位骨肉瘤模型中完全缓解肺转移。值得注意的是，BINP还引起破骨细胞失活，以维持骨基质的完整性，这在一定程度上有利于抑制肿瘤进展。BINP是一种有效的治疗制剂，具有提高抗癌效果、增强肺转移抑制和显著的骨保护作用。研究者首次合成了一种具有生物矿化诱导能力的TME敏感多肽，相信这种精心设计的多功能矿化纳米平台在骨肉瘤治疗中具有巨大的临床应用潜力。--纤维素推荐--
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202203291声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！