撰文 | Qi

胚胎发育和细胞分化是复杂的过程，由影响细胞命运决定的细胞之间的串扰和细胞类型特异性基因表达程序的建立来指导，而谱系追踪研究对于理解这些过程至关重要。最初是利用光学显微镜来追踪细胞分裂，随后barcoding、cre-lox等系统被用于标记前体细胞或祖细胞以读取细胞分化或发育数据，scRNA-seq可提供丰富的表达数据并用于预测发育轨迹，还可以和谱系追踪技术相关联以重建谱系树。尽管这些技术为谱系追踪和建立细胞轨迹之间关系方面提供了重要信息，但无法提供有关基因表达变化的实时信息。

2023年2月23日，来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心的Joost Gribnau团队在Nature Biotechnology杂志上发表了一篇题为 Retrospective analysis of enhancer activity and transcriptome history 的文章，他们使用了一种可诱导的DCM-RNA聚合酶2b亚基（RNA polymerase 2 subunit b）融合蛋白，用不影响基因转录的细菌甲基化标记来标记活性基因和增强子，应用这种DCM“时间机器” (DCM-TM) 技术来研究肠道稳态，揭示肠道细胞分化过程中增强子和附近基因的快速协调激活。此外，这项工作还提供了关于肠道干细胞 (ISCs) 分化中吸收-分泌谱系命运决定的新见解，表明ISCs保留了对于维持其ISC身份和分化相关基因表达所需的独特染色质景观。

已知C_meC(A/T)GG五核苷酸的DCM甲基化是一种细菌形式的胞嘧啶甲基化，在大多数哺乳动物细胞类型中仅检测到非常低的水平，但在体细胞中引入转基因时保持不变，而不影响转基因表达【1】。为了开发基因活性标记系统，作者将细菌甲基转移酶DCM融合到小鼠RNA聚合酶2亚基b的N末端（DCM-Polr2b），将该融合基因引入含m2rtTA 反式激活因子的胚胎干细胞的Col1a1基因座，并开发了MeD-seq，一种基于LpnPI（可识别所有DCM甲基化C_meC(A/T)GG乌核苷酸）介导的CpG和DCM甲基化靶位点消化以产生32bp可测序片段的技术来检测DCM的甲基化【2】。在DCM–Polr2b:m2rtTA ESC中添加dox诱导后，甲基化谱显示转录起始位点（TSS）、基因体和转录末端位点 (TES) 处的DCM甲基化增加，基因表达与DCM甲基化水平之间存在直接关系。通过与已发表的ChIP-seq数据比较，并结合有无dox诱导的全基因组差异甲基化区域（DMR）数据证明DCM在增强子特异性修饰增加，提示DCM-POLR2B可同时用于追踪活性增强子和基因。

图1. DCM-TM和MeD-seq示意图。

为了监测小肠的体内DCM甲基化积累、维持和传递情况，他们还构建了DCM–Polr2b小鼠和m2rtTA;H2B-GFP;DCM-Polr2b报告小鼠，与在 ESC 中观察到的类似，TSS、基因体和 TES 的 DCM 甲基化与基因表达水平、POLR2A 结合、H3K36me3和H3K27Ac富集区域相关，且每次细胞分裂平均DCM甲基化向子代细胞的传递率为56%，说明该方法可用于跨多个细胞分裂的时间窗口的追踪。接下来，作者利用DCM-TM监测在ISCs在分化为肠上皮细胞过程中的基因活性时，不仅发现DCM-TM检测到的基因多于scRNA-seq，且在将MeD-seq与全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS，一种单碱基分辨率分析DNA甲基化的技术）捕获的DCM甲基化进行比较发现，在相似数量的测序读数下，前者可以检测至少120倍以上的DCM甲基化标签。此外，他们利用从绒毛分离的上皮细胞中产生的ChIP-seq和ATAC-seq数据以确认增强子活性是否可以在这一分化过程中追踪，结果显示标记活性启动子和增强子的H3K27ac、DNA可及性和DCM甲基化之间存在明显的相关性。

此前已经证明组蛋白变体H2A.Z与谱系特异性基因激活有关，其中H2A.Z乙酰化(H2A.Zac)与增强子激活相关【3】，CUT&Tag分析表明H2A.Z和H2A.Zac在ISC和肠上皮细胞特异性TSS处积累【4】，而肠上皮细胞中的H2A.Zac富集更为明显，提示H2A.Z可能预先标记了ISCs中的肠上皮细胞特异性增强子，而这些增强子在ISCs分化过程中通过乙酰化被激活。此外，肠上皮细胞中存在的H2A.Z增强子峰的 HOMER motif富集分析显示参与Notch信号和EGF信号转导通路的几个靶标的转录因子结合位点的富集。

为了更好地了解ISCs分化过程中的细胞状态变化，作者对DCM标记的基因进行了KEGG通路分析。发现在早期的与吸收和TGF-β信号相关的通路富集，以及随后包括Wnt、Notch信号等在内的通路富集。其中，Notch信号控制肠道中吸收和分泌细胞的命运决定，通过Hes1、Hes3和Hes5的作用来抑制ISCs和肠上皮细胞祖细胞中的Atoh1。DCM-TM数据显示Notch1以及Notch靶基因（Hes1、Hes3和Hes5），在整个肠细胞分化过程中表达，而主要在分泌细胞类型中表达的Spdef和Gfi1中的DCM甲基化从未超过背景水平，DCM-TM的UMAP表明通常在分泌细胞类型中表达的几种基因在肠细胞祖细胞中被瞬时激活，突出了这些祖细胞的双潜能性质。

全转录组谱系追踪系统的关键参数是引入通常在哺乳动物细胞中不存在的标签，该标签在DNA合成时得以维持和传递，并且不会干扰基因表达。这项研究开发的DCM-TM系统能够在发育或分化过程中的任何时间点提供基因和增强子活性的全基因组图谱，还可通过与传统谱系追踪技术相结合以精细绘制细胞命运图谱。总之，DCM-TM系统可以为细胞状态变化背后的调控网络提供新的见解。

制版人：十一

1. Clark, S. J., Harrison, J. & Frommer, M. CpNpG methylation in mammalian cells. Nat. Genet. 10, 20–27 (1995).

2. Boers, R. et al. Genome-wide DNA methylation profiling using the methylation-dependent restriction enzyme LpnPI. Genome Res. 28, 88–99 (2018).

3. Giaimo, B. D., Ferrante, F., Herchenrother, A., Hake, S. B. & Borggrefe, T. The histone variant H2A.Z in gene regulation. Epigenetics Chromatin 12, 37 (2019).

4. Kazakevych, J., Sayols, S., Messner, B., Krienke, C. & Soshnikova, N. Dynamic changes in chromatin states during specification and differentiation of adult intestinal stem cells. Nucleic Acids Res. 45, 5770–5784 (2017).