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Mol Cell | 冈崎片段上的RNA:DNA杂交链有助于保护复制叉完整性

日期： 来源：BioArt收集编辑：Qi

撰文 | Qi


各种各样阻碍复制叉的因素干扰着DNA复制过程，复制叉断裂和停滞等是导致基因组不稳定的直接来源，也是大多数癌症的标志。因此，研究能在应激复制叉处维持基因组稳定的分子回路至关重要。之前的工作表明RNA:DNA杂交链可以调节DNA修复机器，比如从同源重组（HR）途径和非同源末端连接（NHEJ）途径中募集修复因子，且杂交链需要被移除或降解以完成DNA修复【1-3】。滞后链上的冈崎片段（Okazaki fragment, OF）需要引物酶合成大小为8-12个核糖核苷酸的RNA引物，因此OF是与DNA复制过程固有的RNA:DNA杂交链的潜在来源，但这种生理性RNA:DNA杂交链是否可以调节DSB修复还不清楚。

2023年3月2日，来自法国巴黎文理研究大学的Sarah A.E. Lambert团队在Molecular Cell杂志上发表了一篇题为RNA:DNA hybrids from Okazaki fragments contribute to establish the Ku-mediated barrier to replication-fork degradation 的文章，他们证明RNase H2在处理冈崎片段上RNA:DNA杂交链以克服新生链降解的Ku屏障方面发挥重要作用，RNase H2与MRN-Ctp1轴合作以Ku依赖性方式维持细胞对复制压力的抵抗力。


之前的工作表明RNA:DNA杂合链会在S期积累在RTS1-RFB（复制叉屏障）的上游和下游【4】，且RNase H1和H2活性的缺乏会导致细胞对复制阻断剂和杂合链的积累敏感【5】，因此作者研究了RNase H1和H2在促进RFB复制恢复中的作用，发现在两者缺乏的情况下，在停滞的复制叉处的杂合链会干扰新生链降解，进一步通过对RNase H1和H2野生型及失活突变体的研究确认是RNase H2在其中发挥主要作用。在裂殖酵母和人类细胞中，新生链降解分为两步，首先是Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN)-Ctp1轴产生110 bp大小的间隙，随后是Exo1介导的长约1 kb的切除【6】，因此作者想知道RNase H2和MRN-Ctp1轴之间的联系。遗传分析表明，RNase H2和Rad50（或Ctp1）的缺陷在使用复制阻断剂处理后导致合成致死。此前已经证明Ku限制了复制叉处Exo1活性，且MRN-Ctp1能克服Ku介导的屏障以进行远程切除【6, 7】，研究人员发现在RNase H2和MRN-Ctp1轴之间观察到在复制压力下的合成致死完全依赖于Ku。

在人类细胞中复制叉倒转（即两条新合成的DNA子链与亲代DNA链解开后发生退火而翻转）是促进新生链降解的核酸酶的入口，并为Ku结合提供了双链DNA末端【7】。而RNA:DNA 杂交链可能在受到复制压力而停滞的复制叉处阻止其倒转，为了探索这一点，作者检测了RFB复制叉倒转的形成，发现缺乏RNase H2或两种RNase H活性都不会影响倒转臂的强度，说明复制叉倒转并没有受到RFB处杂交链的影响。接下来，考虑到冈崎片段包含固有的杂交链，作者利用两个编码引物酶催化亚基的温度敏感基因及其突变体（影响RNA引物合成）：spp1-4（D275G、L429P）和spp1-21（D74E、V180G），观察到与WT相比，CPT诱导的Ku80-GFP灶点在两种突变细胞中减少了近2倍，也就是说合成引物缺陷会影响Ku的聚集。上述结果提示Ku可能与杂交链结合，于是作者利用CPT处理的细胞进行免疫沉淀，发现Ku70与杂交链相关。为了判断杂交链是否是Ku的直接底物，作者在体外研究了酵母ku（SpKu）与不同条件处理的DNA双链或RNA:DNA杂交链的相互作用，证明RNA:DNA杂交链是Ku结合的生理底物。综上所述，作者认为倒转臂上嵌入的OF可以为核酸酶和Ku的结合提供底物，RNase H2成为处理所得RNA：DNA杂交链以提供 Exo1 活性的切入点所必需的因子，从而消除Ku介导的新生链降解屏障。


总的来说，这项工作揭示了一种RNA:DNA杂交相关机制来调节Ku介导的新生链降解屏障，MRN-Ctp1轴和RNase H2的协同作用分别促进Ku“驱逐”和RNA:DNA杂交链降解，从而使Exo1降解新生链。这种基于RNA:DNA杂交的机制有助于保护复制叉的完整性和及时的复制恢复，揭示了嵌入DNA中的RNA 在维持基因组稳定性方面被低估的功能。


原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.02.008

制版人：十一



参考文献


1. Dang, T.T., and Morales, J.C. (2020). Xrn2 links RNA: dna hybrid resolution to double strand break repair pathway choice. Cancers (Basel) 12, 1–15. https://doi.org/10.3390/cancers12071821.
2. Li, L., Germain, D.R., Poon, H.-Y., Hildebrandt, M.R., Monckton, E.A., McDonald, D., Hendzel, M.J., and Godbout, R. (2016). DEAD box 1 facilitates removal of RNA and homologous recombination at DNA doublestrand breaks. Mol. Cell. Biol. 36, 2794–2810. https://doi.org/10.1128/MCB.00415-16.
3. Cohen, S., Puget, N., Lin, Y.L., Clouaire, T., Aguirrebengoa, M., Rocher, V., Pasero, P., Canitrot, Y., and Legube, G. (2018). Senataxin resolves RNA:DNA hybrids forming at DNA double-strand breaks to prevent translocations. Nat. Commun. 9, 533. https://doi.org/10.1038/s41467-018-02894-w.
4. Naiman, K., Campillo-Funollet, E., Watson, A.T., Budden, A., Miyabe, I., and Carr, A.M. (2021). Replication dynamics of recombination-dependent replication forks. Nat. Commun. 12, 923. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21198-0.
5. Zhao, H., Zhu, M., Limbo, O., and Russell, P. (2018). RNase H eliminates R-loops that disrupt DNA replication but is nonessential for efficient DSB repair. EMBO Rep. 19, e45335. https://doi.org/10.15252/embr.201745335.
6. Teixeira-Silva, A., Ait Saada, A., Hardy, J., Iraqui, I., Nocente, M.C., Fre´ on, K., and Lambert, S.A.E. (2017). The end-joining factor Ku acts in the endresection of double strand break-free arrested replication forks. Nat. Commun. 8, 1982. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02144-5.
7. Dhoonmoon, A., Nicolae, C.M., and Moldovan, G.L. (2022). The KUPARP14 axis differentially regulates DNA resection at stalled replication forks by MRE11 and EXO1. Nat. Commun. 13, 5063. https://doi.org/10.1038/s41467-022-32756-5.
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