本研究报告了牛乳铁蛋白对2只患有家族性中性粒细胞功能障碍犬（同窝出生，雌雄各1只）的临床效果，并对其遗传背景进行了调查。在这些犬身上观察到严重上呼吸道细菌感染引起的临床症状。长期口服牛乳铁蛋白改善了它们的临床症状（雌犬严重葡萄膜炎，雄犬肺炎咳嗽）。它们的回交犬有相同的父亲，没有表现出细菌感染的临床症状。中性粒细胞功能测试显示回交犬无任何异常。临床表现异常很可能与家族中性粒细胞功能障碍有关，这些病例的母亲可能是这种功能障碍的遗传载体。

关键词：牛乳铁蛋白，家族性犬中性粒细胞功能障碍，遗传背景

在人类患者和几种动物研究中显示，先天性中性粒细胞功能障碍可引起中性粒细胞迁移、粘附、吞噬和氧化杀伤。在25年前的描述中，白细胞粘附缺陷（LAD）是这些先天性中性粒细胞功能障碍之一。在全球范围内报道了数百例LAD患者，显示宿主对细菌、真菌等微生物的先天防御失效，伤口愈合困难。LAD患儿从婴儿时期就开始出现细菌感染，需要长期服用抗生素。

另外，一些纯种犬的LAD病例报告为犬白细胞粘附缺陷（canine leukocyte adhesion deficiency，CLAD）。中性粒细胞CD18等位基因的序列分析已经确定了一个单核苷酸G-C在107位的转换，这导致了在CLAD病例中残基36位的丝氨酸取代半胱氨酸。中性粒细胞功能障碍是由β2整合素转录水平下降引起的，没有突变，导致CD18表达下调。犬表现出与粘附相关的中性粒细胞功能的多种缺陷，因此从幼犬时期开始反复出现细菌感染。

遗传性中性粒细胞功能障碍的治疗非常困难，目前尚无特效药。LAD和CLAD患者需长期抗生素治疗和其他对症治疗复发性细菌感染，但并不能得到完全的改善。在之前的一项两只中性粒细胞功能障碍的同窝犬研究中显示，给予牛乳铁蛋白可提高它们的中性粒细胞功能。本研究详细报道了口服牛乳铁蛋白对中性粒细胞功能障碍同窝犬的临床效果，并对其遗传背景进行了调查。

两只同窝杂种犬患有家族性中性粒细胞功能障碍，诊断为难治性细菌感染。雌犬在出生9个月时出现。从3个月开始观察到鼻气管炎引起的脓性粘液。表现为双眼粘液脓性分泌物，随后逐渐发展为葡萄膜炎。雌犬揉眼睛后出血，视力恶化。经抗生素和干扰素-γ治疗暂时改善后，临床症状迅速复发。第一次体检时，母犬体重8.15kg（体况评分2/5），出现嗜睡、厌食、发热（39.4℃）症状。主要临床表现为严重化脓性结膜炎、鼻气管炎、双侧葡萄膜炎、偶有鼻出血、肺炎伴排痰性咳嗽（图1A）。血液检查显示低白蛋白血症（1.42g/dl）和高球蛋白血症（4.98g/dl）。白细胞计数（WBC）和中性粒细胞计数分别为14,000/µl和7,000/µl。其它血液检查结果均无显著性变化。血清抗犬瘟热病毒、抗腺病毒1、抗腺病毒2抗体均为阴性。前2周，雌犬给予头孢氨苄（30mg/kg，口服，每日2次）、滴洗液（0.3%诺氟沙星和0.1%地塞米松超硫苯甲酸钠）和吸入治疗，但没有观察到临床改善。期间出现恶心、厌食、咳嗽和严重的粘液脓性鼻分泌物伴呼吸困难。

图1. 家族性中性粒细胞功能障碍病例入院首次体检时临床症状（A雌犬，B雄犬）。值得注意的是，在这两个同伴中，常见的进行性粘液脓性眼鼻炎症和细菌过度生长的临床表现相似。在开始口服乳铁蛋白28天后，临床症状明显改善（C和D）。在抗生素和其他对症治疗中，没有观察到这种改善。

另一方面，雄犬因上呼吸道顽固性化脓性炎症而来就诊。这只犬出现了与同窝母犬相似的细菌感染临床症状，但症状在幼犬时期是温和的。第一次来体检，发现严重的粘液脓性眼分泌物、结膜炎、巩膜炎、双侧角膜混浊（图1B）。雄犬体质较差（体重10.4kg，体况评分2/5），出现厌食症。观察到严重的排痰性咳嗽，X线检查显示严重肺炎特征（图2A和2B）。眼部分泌物及支气管灌洗液的细胞学检查显示化脓性炎症，有许多节段中性粒细胞及细菌，犬巴氏杆菌及革兰氏阴性杆菌。如表1所示，血液学检查显示白细胞增多（WBC：22,600/μl，中性粒细胞：18,532/μl），大细胞低色素性贫血（平均红细胞容积；MCV：84.5fl，平均红细胞血红蛋白浓度；MCHC：28.8g/dl）、低白蛋白血症（1.35g/dl）和高球蛋白血症（5.05g/dl）。抗球蛋白试验及抗核抗体均为阴性。其它血液检查结果均无显著性变化。前2周，公犬根据抗生素敏感性试验给予抗生素治疗（氨苄西林钠，30mg/kg，静脉注射，每日3次；奥比沙星，5mg/kg，皮下注射，每日1次）、补液治疗（乳酸林格氏液、氨茶碱、维生素）和吸入疗法。这些治疗效果不佳，雄犬仍然出现厌食、咳痰、眼鼻粘液脓性分泌物。

图2. 中性粒细胞功能障碍雄犬入院首次体检时，侧位（A）和胸腹侧（B）X线片显示为弥漫性肺泡型肺炎。在牛乳铁蛋白治疗140天后，观察到弥漫性肺泡改善，咳嗽和吞气症消失（C和D）。

表1. 中性粒细胞功能障碍雄犬血液学和体格检查结果

治疗前：入院首次体检。

ND：未确定。

之前的研究报道，口服牛乳铁蛋白（一种从牛乳中分离出的80kDa铁结合糖蛋白）可增加免疫缺陷病毒感染猫的中性粒细胞吞噬活性，并改善其顽固性口炎。在雌犬和雄犬体内给予牛乳铁蛋白联合其它对症治疗，包括抗生素治疗，分别治疗一个月和140天。口服牛乳铁蛋白可提高中性粒细胞功能，临床体征和血液学表现均有改善。中性粒细胞功能障碍的雌犬口服乳铁蛋白2周后，上呼吸道细菌感染和角膜混浊的临床症状逐渐改善。乳铁蛋白治疗开始一个月后，结膜炎、葡萄膜炎和鼻炎几乎消失（图1C）。与单一抗生素治疗相比，联合使用乳铁蛋白可有效改善这些临床症状。此后，每次雌犬发生化脓性炎症时，均给予牛乳铁蛋白和抗生素治疗。

中性粒细胞功能障碍的雄犬在给予乳铁蛋白2周内未见明显改善，食欲和体温缓慢恢复正常。此外，粘液脓性眼分泌物和渗出性咳嗽均有轻微减少。乳铁蛋白治疗28天后，渗出性咳嗽和眼鼻粘液脓性分泌物消失，角膜混浊逐渐改善（图1D）。乳铁蛋白治疗94天后，雄犬恢复良好，体重增加至11.15kg，鼻塞和肺炎症状缓解（图2C和2D）。此后，雄犬因主人原因无法服用乳铁蛋白2周，在乳铁蛋白治疗140天后，轻度眼鼻粘液脓性分泌物复发。如表1所示，乳铁蛋白治疗94天和140天，白细胞逐渐下降，血清白蛋白分别上升至2.55和3.09g/dl。此外，乳铁蛋白治疗94天后，大细胞低色素性贫血（MCV：67.4fl，MCHC：27.8g/dl）略有改善。

在前期研究中，在同窝幼崽中出现中性粒细胞功能障碍表明其具有遗传关系。为了检验它们的遗传背景，它们的家谱经主人调查证实。它们的母亲（杂种）在9岁时死亡。父亲（杂种）还活着，但我们无法接触到这只犬。父母没有任何细菌感染的临床症状。它们有5只幼犬（2只雌犬和3只雄犬），其中2只患有中性粒细胞功能障碍，其余3只无临床症状。家族中发生了近亲繁殖。其中一只无临床症状的母犬与其父犬杂交，繁殖出4只幼犬。回交幼犬没有出现细菌感染的临床症状。分别对4只幼犬和4只健康幼犬（作为对照）进行血液学检查和中性粒细胞功能测试。血液学检查显示，4只健康幼犬（雌性1只，雄性3只，2月龄）的白细胞和中性粒细胞分别为13500±1183/µl和7229±1978/µl，而4只回交幼犬（雌性3只，雄性1只，2.5月龄）的白细胞和中性粒细胞分别为11950±1763/µl和6542±1000/μl（平均值±标准差）。回交幼犬血液学检查未见异常。

中性粒细胞功能测试采用的方法与先前的研究相同。统计学差异采用配对t检验，P值<0.05为显著。利用鲁米诺依赖性化学发光反应评估回交犬中性粒细胞超氧化物的产生，以明确回交犬是否存在中性粒细胞功能障碍。将通过离心分离的外周血中性粒细胞（5×105细胞）与Ficoll-Conray溶液（密度1.077）、700µl HBSS和100µl 100µM鲁米诺混合。通过添加200μl血清调理酵素（5mg/ml）激活混合物，并使用发光计测量化学发光。结果所示，与正常幼犬（105,570±56172/sec）相比，所有回交幼犬的中性粒细胞依赖鲁米诺的化学发光反应有所增加（峰值高度，136,454±38,755/sec）。回交幼犬的反应峰值时间（669±33秒）与正常幼犬（815±79秒）相比没有延迟。回交幼犬鲁米诺依赖性化学发光反应曲线与对照组相比正常。与健康幼犬（23.51±2.63%）相比，回交幼犬（26.28±6.91%）在中性粒细胞粘附尼龙纤维方面表现出相同的水平。流式细胞法测定荧光微球对回交幼犬和健康幼犬中性粒细胞非特异性吞噬率分别为37.65±5.73%和51.72±15.39%。由于中性粒细胞功能障碍的雄犬CD11b/CD18表达降低，故采用全血流式细胞法分析回交幼犬中性粒细胞CD11b/CD18的表达。回交幼犬和健康幼犬中性粒细胞表面CD11b的表达量分别为16.93±4.83%和10.38±3.71。回交幼犬CD18表达量（73.13±2.79%）显著高于健康幼犬（54.70±10.15%）（P<0.05）。个体化回交幼犬中性粒细胞功能测试均未见异常。因此，这一观察结果表明，与之前研究中描述的2只中性粒细胞功能障碍的犬相比，所有回交幼犬都不存在中性粒细胞功能障碍。

本研究报道了2只患有家族性中性粒细胞功能障碍同窝犬的遗传背景，详细研究了牛乳铁蛋白对它们的临床效果。幼犬时期有反复细菌感染病史，窝伴中性粒细胞功能障碍提示有遗传关系。经过主人的调查，发现了该群体的近亲繁殖。中性粒细胞功能检测显示，与2例患者有相同父亲的回交犬无任何疾病。因此，在族群中，临床表现异常很可能与中性粒细胞功能障碍有关，2只同窝犬中性粒细胞功能障碍的母亲可能是本病的遗传载体。

本研究显示，长期口服牛乳铁蛋白可改善2例家族性中性粒细胞功能障碍犬严重细菌感染的临床症状。中性粒细胞功能障碍犬的临床症状在出生后不久就表现出来，出现鼻气管炎和眼炎伴发热，随后出现反复的严重细菌感染。它们的主要临床特征是频繁和进行性粘液脓性眼鼻炎症伴细菌过度生长、肺炎和发热。临床病史与感染CLAD的爱尔兰雪达犬和感染牛白细胞粘附缺陷病（BLAD）的牛结果一致。对CLAD或BLAD感染动物的血液学研究显示，白细胞持续显著增多，中性粒细胞占外周血白细胞的90%（CLAD为500,000/μl, BLAD为80,000/μl）。在本中性粒细胞功能障碍犬病例中没有观察到严重的中性白细胞增多症。在本犬病例中所见的高球蛋白血症提示，曾频繁发生严重的细菌感染。此外，该2例病例可以生长到成年年龄，而大多数CLAD感染的犬通常在6个月大时死于细菌感染并发症。这些发现可能表明，在这2只犬中，此类型中性粒细胞功能障碍的症状比CLAD症状轻。

在CLAD或BLAD感染的动物出现临床症状时，第一治疗阶段是长期抗生素治疗。多项研究报道部分抗生素或粒细胞集落刺激因子对中性粒细胞功能有抑制作用。大多数患有CLAD或BLAD的动物通常死于严重的细菌感染。最近，在CLAD研究中报道了干细胞基因治疗遗传性中性粒细胞功能障碍。然而，该疗法在应用于临床病例之前，还有许多问题需要解决，例如不良反应或高昂的医疗费用，并不能立即应用于临床。因此，目前先天性中性粒细胞功能障碍的治疗方案有限。我们对患有中性粒细胞功能障碍犬的治疗与患有CLAD犬的治疗相似。然而，单纯对症治疗并不能改善中性粒细胞功能障碍犬严重细菌感染的临床症状和血液学表现。因此，家族性中性粒细胞功能障碍的病例需要一种能够调节中性粒细胞功能而不产生不良反应的长期治疗方法。乳铁蛋白是宿主一级防御系统抵御感染的关键因子之一。先前研究报道，口服牛乳铁蛋白可增强免疫缺陷病毒感染猫的中性粒细胞吞噬活性。口服牛乳铁蛋白治疗可调节健康犬和猫的中性粒细胞功能。此外，口服牛乳铁蛋白可增加健康志愿者的吞噬活性和超氧化物产生或降低外周中性粒细胞粘附发生率。外源性乳铁蛋白具有多种生物学功能，包括抗炎和免疫调节活性。在本研究中，口服牛乳铁蛋白联合其它对症治疗方法，改善了2只中性粒细胞功能障碍同窝犬的临床症状。同时，本研究中，雄犬经乳铁蛋白治疗后，血液学检查炎症标志物逐渐降低。综上所述，长期口服牛乳铁蛋白可以通过增加这些犬的中性粒细胞功能来改善重症鼻气管炎、眼炎、肺炎等临床症状。虽然还需要进一步的研究，但这表明口服牛乳铁蛋白有潜力作为中性粒细胞功能障碍的治疗方案之一，而不会产生无法预料的副作用。