背景介绍

二氧化碳的过度排放及其对全球气候变化和社会经济产生的负面影响，让人们意识到提出和推广一种兼顾经济可行性和环境友好性的新型生产模式的重要性。尽管二氧化碳可以凭借可再生电能或太阳能转化为C₁和C₂产品，但直接将二氧化碳转化为长链化合物仍然面临着巨大的挑战。β-法尼烯作为一种无环倍半萜类化合物，其加氢产物法尼烷具有出色的燃烧性能，是一种优良的生物燃料。先前的研究已经证明了利用微生物生产β-法尼烯的可行性和潜力，然而如果能以二氧化碳或基于二氧化碳的底物为原料，转化二氧化碳获得β-法尼烯，不仅能够促进碳中和目标的实现，还能将作为工业废气的二氧化碳再循环到全球经济之中。在微生物体内，β-法尼烯的合成面临着前体、能量和还原力供给的问题，代谢工程、微生物发酵和电化学二氧化碳还原反应（CO₂RR）的耦合在生物合成β-法尼烯方面彰显出巨大的潜力。

文章内容

设计生物电催化系统合成β-法尼烯

可扩展的电催化系统和生物增值过程的耦合使得从二氧化碳生产生物燃料成为可能。为了建立这种电化学-生物混合途径，选择乙酸和甲酸分别作为碳的中间体和还原性当量以有效地串联二氧化碳电催化和微生物发酵。对于发酵底物的制备，使用Ni-N-C单原子催化剂将CO₂转化为CO，然后使用铜（Cu）催化剂和固态电解质反应器将其进一步还原为乙酸；使用Pb₁Cu催化剂和固态电解质反应器来制备甲酸。该研究设计并构建了如图1所示的生物燃料合成过程，在特定的固态电解质反应器中以二氧化碳为原料合成乙酸和甲酸，之后它们被适当地浓缩或稀释以满足微生物发酵的需要。这一过程设计的优势在于能够避免微生物对CO₂RR电极的干扰，简化反应器和管道，有助于实现发酵过程的精确控制。

设计多底物生物转化策略促进β-法尼烯合成

该研究设计并建立了一种多底物转化策略，该策略中所述的底物转化系统被分为三个不同的模块，包括乙酰-CoA合成模块（模块1）、还原力供给模块（模块2）和ATP再生模块（模块3）。过表达优选的乙酸-乙酰辅酶A合成酶和泛酸酯激酶能够分别为β-法尼烯合成前体乙酸辅酶A提供充足的乙酰基和辅酶A基团，而引入的甲酸脱氢酶可以通过分解甲酸（盐）产生NAD(P)H，为萜烯提供还原力。针对乙酸同化和萜烯合成过程中消耗的大量ATP，通过过表达异源聚磷酸盐激酶，以多聚磷酸盐为磷酸基团供体，可以增强胞内ATP的再生。最终，重组菌株BYL15的β-法尼烯产量达到370.4 ± 13.6 mg L^-1，比出发菌株BYL01的β-法尼烯产量提高了235.5%（如图2B所示）。

电催化生产的乙酸溶液中含有约3 wt%的乙醇和正丙醇杂质，为了探究电催化生产的乙酸和甲酸对发酵的影响，该研究使用等摩尔量的氢氧化钠将电催化生产的乙酸和甲酸中和为乙酸钠和甲酸钠。接下来，分别将菌株BYL15接种于含电催化乙酸钠（甲酸钠）和商品乙酸钠（甲酸钠）的培养基中进行发酵。该研究发现，在摇瓶中使用商业化乙酸钠（甲酸钠）组和电催化乙酸钠（甲酸钠）组的菌株生长状况和β-法尼烯产量都十分接近，这初步表明利用电催化固定二氧化碳耦合微生物发酵生产β-法尼烯是可行的（图3A, B）。在发酵罐实验中，实验组的细胞生长趋势和β-法尼烯产量与对照组中的基本相同。随着乙酸和甲酸的补加，仅在实验组发酵前期的发酵液中检测到了微量的乙醇和正丙醇积累（图3C）。分批补料的发酵结果进一步验证了电催化-生物转化系统的有效性和稳定性。

转录组学分析显示β-法尼烯的合成受到多底物生物转化策略的影响

采用转录组学方法分析菌株BYL15和BYL01之间相关基因转录水平的差异。其中，在细胞的对数生长期中晚期样品中发现了45个DEGs（2个上调，43个下调），在稳定生长期中期样品中发现了1504个DEGs（668个上调，836个下调），在稳定生长期晚期样品中发现了2562个DEGs（1127个上调，1435个下调）。这些结果可能意味着多底物生物转化策略的采用在发酵过程中逐渐影响了某些基因的表达，因此进行KEGG路径分析和GO富集分析来进一步揭示增强β-法尼烯合成和促进细胞生长的转录机制。GO分析表明，差异基因的富集与膜组分和离子运输有关，后续研究Y. lipolytica的形态和膜组分以增强其对乙酸（盐）和甲酸（盐）的耐受性是可行的；KEGG路径分析结果显示BYL15中明显富集的基因通路主要与丙酮酸代谢、MAPK信号通路、氨基酸糖和核苷酸糖代谢以及辅因子的生物合成有关。转录组分析有助于深入发掘工程菌株中关于加强乙酸（盐）利用和β-法尼烯合成的转录机制，为进一步开发乙酸（盐）转化的微生物细胞工厂提供理论支持。

优化β-法尼烯分批补料发酵条件

对以乙酸为碳源发酵条件下的胞内乙酰辅酶A、ATP、NAD(P)H的合成和消耗量进行计算，探究补料培养基中乙酸、甲酸的添加比例，防止发酵过程中底物配比失衡。优化后的底物补加策略大大降低了发酵液中乙酸（钠）的积累，在发酵80 h后罐内乙酸（钠）浓度开始下降，随后均维持在20 g L^-1以下。以2:1的摩尔比混合补加乙酸和甲酸更有利于细胞生长和β-法尼烯合成，OD₆₀₀最高可达130，β-法尼烯产量达14.8±0.23 g L^-1。合理配比的乙酸、甲酸浓度有利于降低因底物积累引起的细胞负担，并为细胞生长和β-法尼烯合成均衡地供给合成前体。

展望

本研究展示了一种生物电催化耦合系统，该系统可以从二氧化碳和电力中生产高附加值的长链生物燃料来替代化石燃料。经计算，该生物电催化耦合系统从二氧化碳中生产β-法尼烯的总体能量效率约为0.75%。该研究采用纳米结构的铜催化剂和单原子铅合金铜催化剂（Pb₁Cu），在固体电解质反应器中稳定地将二氧化碳转化为乙酸和甲酸，并设计了一种多底物生物转化策略用于供应乙酰-CoA、NAD(P)H和ATP来增强β-法尼烯的合成和细胞生长。基于二氧化碳电催化和微生物发酵的β-法尼烯合成工艺不仅能够将二氧化碳有效地转化为生物燃料，还有望被进一步应用于各种先进分子材料的生产之中，在化学合成和新能源领域都发挥出重要作用。