文献信息：AJankowska, K.;Sigurdardóttir, S. B.; Zdarta,
J.; Pinelo, M., Co-immobilization and compartmentalization of cholesterol
oxidase, glucose oxidase and horseradish peroxidase for improved thermal and H2O2stability. Journal of Membrane Science 2022, 662, 121007.（点击文末阅读全文可直达）
1. 研究领域存在的问题
葡萄糖氧化酶(GOX)和胆固醇氧化酶(COX)常用于医学分析，检测生物溶液如人血液或分泌物中的葡萄糖和胆固醇。在氧分子存在的条件下，GOX和COX催化反应会产生副产物过氧化氢，因此可以将产生的过氧化氢作为共底物，由辣根过氧化物酶（HRP）进行快速级联反应，由于GOX和COX催化反应的主要产物难以检测，这种利用HRP快速鉴定的方法可大大加快生物传感效率。然而，这种生物传感器中存在酶活性低、不可重复利用以及高成本等问题，目前关于固定GOX，COX或HRP级联酶反应的研究还十分有限。
2. 创新点与科学假说
本文提出了一种以商品化UFX5膜和PDLG电纺丝纤维为载体的新的酶固定化方法，将辣根过氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶（GOX）或胆固醇氧化酶（COX）分区固定在所选择的膜载体上。此外，除了酶区室化之外，还进行了酶共固定化，以便能够比较酶固定化的效率和所构建的生物系统的生物催化效率。具有HRP和GOX、HRP和COX的生物系统也可被用于级联反应，使ABTS转化为其自由基对应物。
图1 多酶生物系统的构建及载体和聚电解质层与酶相互作用的机制
3. 实验制备
酶共固定化：将粉末形式的HRP和GOX或COX称重，与pH为7的磷酸盐缓冲溶液混合，得到浓度为1 mg/mL的酶溶液（HRP：GOX或COX的质量比为1：1）。然后，通过非共价键共固定在电纺丝纤维和膜上制备多酶生物体系。
层层自组装（LbL）：用PDLG电纺丝材料和商业UFX5膜作为载体，生产具有分隔酶的聚电解质多层膜。首先，将1 mL浓度为0.5 mg/mL的HRP溶液在膜或电纺丝纤维培养1小时。再将其先后浸泡在聚苯乙烯磺酸钠（PSS）溶液和聚乙烯亚胺（PEI）溶液中形成聚电解质涂层。将制备好的聚电解质涂层改性载体放置在浓度为0.5 mg/mL的GOX或COX溶液培养1小时。最后在多酶固定化的载体上进行聚电解质LBL涂层将酶包埋。
4. 实验结果
4.1. 固定化效率和生物催化能力
不同的载体和固定化方法会影响固定的生物分子数量。由于膜的孔隙率较高，更多的生物分子被固定在密度更大（更小的孔径）基质上，即UFX5膜。对于酶固定化的类型，当使用LbL改性膜时，由于静电相互作用，更多的生物分子能够附着在生物系统上。与固定化酶相比，ABTS*与自由酶反应后的生物催化效率最高，这是由于空间位阻限制了底物运输到固定化酶催化活性中心。此外，利用LBL法制备的具有酶区室化结构的固定化酶生物催化效率高于共固定化和附着在静电纺丝纤维上，一是因为该方法可以固定更多数量的酶，且稳定性提高；另外，作者认为聚电解质引起的酶分隔也导致 H2O2与O2活性竞争效应减少，进而可以提升H2O2催化效率。从工业催化视角来看，相较于游离酶，固定化酶可以保持较高的活性，重复利用性好，在长期使用下可以大幅降低运行成本。
4.2. 稳定性测试
与其他系统相比，UFX5膜基生物系统在45℃和65℃下模型反应的转化效率更高。在65℃下，使用UFX5/ HRP/LbL/GOX生物系统可以转化超过50%的ABTS。此外，H2O2浓度对生物系统催化反应的影响也很重要，H2O2浓度过高会发生“底物抑制”，导致酶活性的降低。通过实验发现，使用LbL方法固定在UFX5膜上的酶对H2O2的稳定性更高，H2O2的负面影响在固定化后明显降低。
图2 温度和H2O2浓度对生物系统的影响。
可重复利用性是决定固定化酶是否能应用在大规模工业生产中的一个重要因素。经过5次催化循环后，UFX5/HPR/LbL/GOX生物系统和UFX5/HPR/LbL/COX生物系统的效率分别达到89%和34%，并且载体的酶泄露率小于10%。可重复利用性的结果与洗脱试验的结果一致，这表明ABTS相对转化率的降低可能是因为生物催化体系中生物分子的逐渐洗脱。由于酶共固定化的分子相互作用力较弱，酶容易被洗脱，所以酶LBL固定化的生物系统在可重复使用性方面比酶共固定化的生物系统具有优势。此外，结果表明，固定化方法和所使用的载体类型都显著影响酶的洗脱，基于UFX5膜的酶分隔生物系统阻止了生物分子的洗脱，具有更好的转化ABTS的潜力。
图3 生物系统的可重复利用性和洗脱试验
5. 思考与启发
本文提出并制备了一种新的级联生物系统，该系统采用商品UFX5超滤膜和PDLG电纺纤维固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶或胆固醇氧化酶。应用了两种固定化方法：共固定化和在聚电解质层间分隔酶。实验生物系统用于葡萄糖或胆固醇和ABTS的级联转换。研究表明具有酶区室化结构的基于UFX5超滤膜的生物系统比基于电纺纤维的固定化酶具有更高的催化性能。此外，固定化后生物系统降解H2O2反应的可重复使用性和稳定性显著提高。本文所提出的酶固定化方法和载体的选择所获得的结果也可用于其他酶级联反应和新的多功能生物催化平台的生产。对于这项研究，我还有一些补充思考：（1）分层催化每层的效率如何，每层的效率与总体效率之间有什么联系？（2）层层组装的通量是否会大幅下降，这种下降可以接受吗？
导师评语：基于层层自组装（LBL）的酶固定化是近期研究热点，本文以不同的载体对比了直接物理吸附和LBL形成酶区室化结构的两种酶固定化策略，发现LBL法在多酶固定化上的优势。不过本文中膜仅仅是一个载体而已，并未起到分离作用，而且应用背景有点不太清楚，如果是生物检测，其实不存在工业规模应用的问题。另外，聚电解质层应该是很薄的，其实每层酶之间的距离都是纳米级的，催化效率应该不会有明显下降。LBL层对通量影响应该不会特别大，而且可通过层数和聚电解质种类来控制渗透性，也可以选用大孔的基膜，使催化膜的通量满足要求。
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