撰文 | 存中一贯 DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）是最常见的DNA损伤形式。核酸酶或者辐射引起的双末端DSBs能够被以下几种DNA修复系统进行修复：非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ），同源重组（homologous recombination, HR）以及微同源末端连接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）。MMEJ是依赖于微小同源序列（约为3-20 bp）的退火进行的末端修复方式【1,2】。MMEJ的功能发挥依赖于聚合酶θ（polymerase theta, Polθ, 由基因POLQ编码），除此之外，PARP1, FEN1, XRCC1以及连接酶3（ligase 3）都与MMEJ的功能发挥密切相关【3,4】。有研究显示，MMEJ大部分时候是作为NHEJ和HR修复系统的备选系统，当前两个修复系统功能丧失时，MMEJ才会发挥作用。然而，也有研究显示在一些肿瘤细胞中，或者Cas9诱导的DSBs情况下，MMEJ也能促进DNA的修复【5】。 在单末端DSBs（single-ended DSBs, seDSBs）的修复过程中，NHEJ是被抑制的，主要发挥作用的是HR，而MMEJ作为补充。而在HR丧失功能（HR-deficient, HRD）的肿瘤细胞中，PARP抑制剂具有很强的选择性杀伤作用。不过，临床应用显示，HRD细胞中依然有50%的细胞会对PARP抑制剂产生耐药性，此时可联合应用Polθ抑制剂，而且由于POLQ在肿瘤细胞中高表达，而在普通细胞中表达很少，这种联合用药往往能发挥很好的作用【6】。不过，这种情况也带来一个新的问题，那就是，MMEJ发挥功能的过程中，是否还有其他蛋白促进了Polθ的作用，是否有其它蛋白在这个过程中发挥关键作用并可作为相关肿瘤的药物开发靶点呢？ 2023年4月11日，来自美国科罗拉多大学博尔德分校的Nausica Arnoult团队在Molecular Cell杂志发表了他们最新的研究成果，题目是 The APE2 nuclease is essential for DNA double-strand break repair by microhomology-mediated end joining，他们鉴定了微同源末端连接的一个新的关键核酸酶APE2，并解析了APE2在MMEJ修复DNA的过程中发挥作用的具体分子机制。 为了鉴定MMEJ新的关键基因，研究人员采用了CRISPR-Cas9的筛选策略。同时，为了排除个别基因本身导致的细胞死亡之外，研究人员选用了HT1080细胞（HRD细胞）中稳定敲低BRCA1或者PALB2作为背景细胞。筛选结果首先选出了已报道的和MMEJ相关的基因，比如PARP1, XRCC1, NBN, LIG3, POLQ以及FEN1。除此之外，还有三个基因CIP2A, ALC1和APEX2（编码APE2）之前并未发现与MMEJ功能相关。其中，APE2是一个核酸酶，与氧化损伤修复相关。 接下来，研究人员在细胞中敲除端粒保护蛋白复合体（Telomere-bound Shelterin complex）中的Shelterin以启动DNA损伤应答，然后通过联合敲除TRF2和XRCC5（编码Ku80），达到抑制NHEJ和HR活性，激活MMEJ活性的效果。在这个体系中，研究人员分别检测了APE2、CIP2A和ALC1对MMEJ活性的影响。结果显示，只有敲除APEX2影响了MMEJ的活性，而敲除CIP2A和ALC1对MMEJ活性没有影响，说明APE2是MMEJ活性调控的一个关键蛋白。为了进一步验证APE2对MMEJ的影响，研究人员构建了一个mCherry报告基因系统，用于检测MMEJ活性，发现敲除APEX2与敲除POLQ一样，都会损伤MMEJ对DNA的修复作用。 APE2属于核酸酶中的ExoIII家族，它具有三个已知功能的结构域，分别具有内切酶活性、3’-5’的外切酶活性以及磷酸二酯酶活性（endonuclease, 3’-5’ exonuclease and phosphodiesterase, EEP）。为了检测APE2在MMEJ中发挥功能是否依赖于EEP活性，研究人员构建了两个氨基酸点突变（D196N和D276A）失活EEP酶活性，然后在之前的研究体系中检测突变质粒的功能。结果显示，失活突变质粒的过表达不能拯救APEX2敲除引起的MMEJ缺陷，说明APE2在MMEJ中发挥的功能依赖于其EEP酶活性。 除了催化结构域之外，APE2还含有一个PCNA结合肽段（PCNA-interacting peptide, PIP）以及一个锌指motif（zf-GRF）。但进一步实验检测发现，APE2的功能完全不依赖于PIP结构域，而zf-GRF也仅对APE2的功能起到部分作用，而且zf-GRF发挥的作用主要是其DNA结合能力在促进MMEJ功能，而不是其PCNA结合能力。 有意思的是，研究人员从AlphaFold2模拟的结构中找到了APE2中两段保守序列CR1和CR2。进一步的实验显示，这两段序列对APE2介导的MMEJ功能发挥是非常必要的。CR1促进了DSBs招募APE2的过程，进而促进了MMEJ。 最后，研究人员确认，APE2的核酸内切酶活性以及外切酶活性，使得它在MMEJ中的功能主要是切除微同源末端配对后产生的3’末端序列，以便后续由Polθ介导的序列修复的顺利进行。 总之，本研究鉴定了一个新的MMEJ关键酶APE2，它的核酸酶活性是MMEJ发挥功能必不可少的，本研究解析了APE2介导MMEJ过程的具体分子机制，为相关生物过程的理解以及相关肿瘤靶向药物开发提供了新的思路。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.03.017
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参考文献
1. Daley, J.M., and Wilson, T.E. (2005). Rejoining of DNA double-strand breaks as a function of overhang length. Mol. Cell. Biol. 25, 896–906.2. Chang, H.H.Y., Pannunzio, N.R., Adachi, N., and Lieber, M.R. (2017). Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double strand break repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 495–506.3. Sharma, S., Javadekar, S.M., Pandey, M., Srivastava, M., Kumari, R., and Raghavan, S.C. (2015). Homology and enzymatic requirements of microhomology-dependent alternative end joining. Cell Death Dis. 6, e1697.4. Simsek, D., Brunet, E., Wong, S.Y., Katyal, S., Gao, Y., McKinnon, P.J., Lou, J., Zhang, L., Li, J., Rebar, E.J., et al. (2011). DNA ligase III promotes alternative nonhomologous end-joining during chromosomal translocation formation. PLoS Genet. 7, e1002080.5. Schimmel, J., Kool, H., van Schendel, R., and Tijsterman, M. (2017). Mutational signatures of non-homologous and polymerase theta-mediated end-joining in embryonic stem cells. EMBO J. 36, 3634–3649.6. Higgins, G.S., and Boulton, S.J. (2018). Beyond PARP-POLtheta as an anticancer target. Science 359, 1217–1218.