【目的】核酸的甲基化修饰是一种常见的化学修饰形式，具有重要的生物学功能，却也在一定程度上给一些核酸研究过程带来了技术难度。tRNA上具有的大量甲基化修饰会阻碍逆转录进程，从而降低荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)和高通量测序对其的检测效率。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的AlkB蛋白是一种多功能的脱烷基化酶，可以去除DNA和RNA上多种甲基化为代表的修饰，有望解决以上问题。【方法】针对大肠杆菌来源的AlkB，分别尝试在大肠杆菌和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中进行诱导表达和纯化，对纯化获得的AlkB进行酶学性质测定。最后以tRNAIle UAU等两种tRNA为代表，研究AlkB的处理对于荧光定量PCR法检测tRNA表达水平的影响。【结果】AlkB在大肠杆菌中表达时多以包涵体形式存在，但是在毕赤酵母中可以成功分泌表达。使用镍柱分离纯化后获得了纯度高于95%的AlkB蛋白，其酶学性质参数如下：最适反应温度为25 ℃，最适pH值为6.5，V_max为0.39 μmol/(L·min)，K_m为3.23 μmol/L，比酶活为1.08 U/mg。AlkB对RNA的处理可以增加荧光定量PCR对tRNA表达水平检测的准确度。【结论】AlkB可以在毕赤酵母中高效表达并纯化，其处理有助于荧光定量PCR对于tRNA的检测结果变得更准确。AlkB的各项酶学性质特征在相关理论研究和应用中具有一定的科学价值。