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来源：科学百晓生收集编辑：Sylvia
▲第一作者：Mingsheng Zhu, Jie Zhuang
通讯作者：Jie Tian，Xiyun Yan，Xinglu Huang
通讯单位： 中国科学院自动化研究所，中国科学院大学，南开大学
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01323-4
跨越内皮细胞的转运是提高抗癌药物输送效率的一个重要过程。肿瘤血管的内皮细胞含有内皮细胞之间的空隙（例如内皮细胞间的空隙）和跨细胞的栅栏（例如囊泡器（VVO））。在这种血管渗漏的基础上，1986年有学者提出了增强渗透和保留机制，并被认为是开发肿瘤靶向纳米载体的核心原则。最近的一项研究表明，高达97%的纳米颗粒是通过主动的跨内皮运输机制进入肿瘤的，而不是通过被动的外渗。这一结论在研究界引起了巨大争议，但确实提供了一个 "警钟"，将研究转向对血管通透性机制的异质性的描述。然而，目前缺乏可用的定量策略，这极大阻碍了理解纳米颗粒的血管渗透性的进展。为了解决这个问题，本研究利用基于蛋白质的纳米探针和基于图像分割的机器学习（nano-ISML），提出了一种单血管定量分析方法。本研究利用nano-ISML，对32个肿瘤模型中超过67,000个单独的血管进行了量化，揭示了基于蛋白质的纳米颗粒的高度异质性血管渗透性。在不同的肿瘤中，高渗透性血管的百分比有>13倍的差异，与最低渗透性的血管相比，最高渗透性的血管的渗透能力有>100倍的差异。本研究的数据表明，被动外渗和跨内皮运输分别是高渗透性和低渗透性肿瘤血管的主导机制。为了体现纳米ISML辅助的纳米医学药物的合理设计，本研究开发了基因定制的蛋白质纳米颗粒，在低渗透性肿瘤中具有更好的跨皮层运输。本研究描述了肿瘤血管渗透性的异质性，并为下一代抗癌纳米药物的合理设计确定了一个方向。1、为了对血管通透性进行定量分析，本研究通过将荧光-染料标记的蛋白质纳米探针的血管通透性与图像分割中的ML获得的优势相结合，创立了一种单血管分析方法。其工作流程如图1a所示。2、基因重组的人类铁蛋白纳米笼（FTn）被选为模型纳米颗粒，因为它们拥有可重复的、均匀的尺寸（即12纳米）和结构，并且在染料标记后可以被观察到。为了了解FTn的体内动态行为，本研究首先将Cy5.5标记的FTn施用于肿瘤小鼠的体内成像。在肿瘤中观察到FTn的爆发性积累，并在给药后30分钟达到最大积累。3、深度学习已被广泛用于自动图像分割。为了定量分析从肿瘤组织中获得的图像的血管渗透性，本研究接下来开发了一个基于ML的模型（图1b）。利用这个模型，从输入图像中自动分割出血管轮廓和FTn覆盖区域的边界，然后提取来自血管和FTn渗透的参数。▲图2|使用纳米ISML方法对异质血管渗透性进行定量分析1、为了确定图像的隐藏特征，本研究收集并分析了足够多的血管，每个肿瘤至少有1000个血管，在32个肿瘤中总共分析了67530个血管。对每个被评估的血管优先单独分析了九个重要指标，包括血管面积（VA）、FTn穿透面积（PA）、FTn穿透量（FA）、FTn穿透面积比（PR）和血管通透性（VP）。本研究首先比较了人工标注和机器分割提取的特征分析，结果发现机器模型得到的分割图像与人工标注的高度相似。随后，将9个指数归一化并显示为热量图，血管、FTn和血管-FTn指数的结果表明，不同肿瘤模型类型的血管通透性具有高度异质性（图2a）。2、为了更好地了解血管通透性的异质性，本研究选择了PR和VP作为进一步数据挖掘的指标。使用纳米ISML来量化各种肿瘤中血管的平均PR。有代表性的单个血管及其相应的FTn穿透率以与长度尺度相关的几何分割区域显示（图2b）。3、对32个肿瘤的所有血管的定量分析表明，平均PR从1.70到9.52不等（图2c），最高的血管PR比最低的血管PR大>100倍。因此，本研究通过对肿瘤通透性的评分将肿瘤分为两类，使用PR的临界值为4，从而将肿瘤分为高通透性（HP）和低通透性（LP）两类。4、结果表明，DAN-G、Hep3B、HepG2、HT29、MCF-7、MX-1、PC3、SMMC-7721和SW-1990是HP肿瘤，而其他肿瘤显示出低渗透性。为了进一步阐明单个血管的渗透能力，本研究还进行了小提琴图分析，以可视化VP值的分布。如图2d所示，在每个肿瘤的血管中观察到VP的高度异质性分布，表明同一肿瘤类型中的不同血管的血管渗透性是高度异质性的。1、为了探索肿瘤血管的渗透机制，本研究使用Zombie模型来评估FTn的渗透，这个模型能够估计被动外渗和主动跨内皮运输的贡献程度。使用纳米ISML，选择HT29和3LL肿瘤（分别为HP和LP肿瘤）来分析FTn在Zombie模型和对照肿瘤小鼠中的渗透。共聚焦图像和小提琴图分析显示，FTn在对照组HT29肿瘤中的血管渗透性与Zombie HT29肿瘤一致（图3a）。然而，与对照组3LL肿瘤相比，Zombie 3LL肿瘤的渗透性明显降低。这些结果意味着FTn在HP肿瘤和HP血管中的渗透主要依赖于被动的外渗机制，而在LP肿瘤中主动的跨内皮运输起着主导作用。2、为了进一步确定所涉及的主动运输过程，本研究首先关注了3LL肿瘤的主动捕获-吸收机制。通过TEM观察到三种主要的捕获-吸收机制：针吞作用、吞噬作用和受体介导的内吞作用（图3b）。3、通过计算FTn-IO的数量，确定针吞作用是FTn-IO的主要捕获-吸收机制。在典型的内皮细胞中，针吞作用、吞噬作用和受体介导的内吞作用的FTn-IO分别占82.9±2.6%、14.8±2.2%和2.3±0.5%(图3c)。1、接下来，本研究分析了定制的FTn变体是否改善了内皮细胞的运输性能。首先，研究了FTn及其变体的细胞内活动，包括细胞吸收、细胞内传输和细胞外渗。共聚焦图像显示，FTn及其变体在与HUVECs孵化后被细胞有效吸收（图5a）。与FTn在溶酶体中的独家分布不同，FTn的变体在吸收后部分定位到溶酶体中。2、此外，本研究发现H2E-FTn、HSA-FTn和HSA/H2E-FTn与高尔基体共同定位，而FTn在高尔基体的分布可忽略不计（图5b）。吸收后再培养6小时，FTn变体的外渗明显高于FTn的外渗（图5c）。定量分析进一步验证了FTn变体的运输功效的增强。基于高尔基体在细胞外渗中的作用和上述结果，本研究总结了FTn及其变体的潜在细胞内活动，如图5d所示。1、本研究还关注了FTn变体是否可以通过增强血管通透性来改善治疗效果。首先比较了静脉注射FTn及其变体后的体内行为。结果表明，H2E和/或HSA的加入并不明显影响FTn的体内血液循环时间。通过对LP和HP肿瘤的成像和监测，进一步研究了FTn及其变体在体内的肿瘤积累和生物分布情况。为此，将SKBR3和HT29分别同时接种到同一小鼠的左肩和右肩（图6a）。观察到FTn及其变体在LP和HP肿瘤中都有明显的肿瘤积聚，与LP肿瘤相比，HP肿瘤的积聚更大。对LP/HP比率的定量分析表明，与FTn相比，FTn变体导致12小时的LP：HP比率提高。12小时时LP:HP比率的提高高于1小时时观察到的比率，特别是对于HSA/H2E-FTn。这些结果表明，活跃的跨内皮层转运的贡献是有效的。2、共聚焦图像显示，Dox负载的FTn和FTn变体在被吸收后成功释放，并传递到肿瘤细胞的细胞核中。随后，将Dox负载的FTn（FTn-Dox）、Dox负载的H2E-FTn（H2E-FTn-Dox）、Dox负载的HSA-FTn（HSA-FTn-Dox）和Dox负载的HSA/H2E-FTn（HSA/H2E-FTn-Dox）每3天静脉注射到移植有LP肿瘤（即3LL，SKBR3）和HP肿瘤（即HT29）的小鼠体内。正如预期的那样，无论肿瘤是LP还是HP，全身给药的Dox-loaded FTn和FTn变体都能显著延迟肿瘤的生长（图6b）。3、与H2E-FTn-Dox和HSA-FTn-Dox相比，HSA/H2E-FTn-Dox在LP肿瘤中表现出协同治疗作用，但在HP肿瘤中没有观察到这种作用。与H2E-FTn-Dox和HSA-FTn-Dox相比，用HSA/H2E-FTn-Dox治疗的LP肿瘤异种移植小鼠的存活率也得到有效改善。相比之下，HSA/H2E-FTn-Dox与FTn-Dox、H2E-FTn-Dox和HSA-FTn-Dox相比，没有明显推迟HP肿瘤小鼠的生存期（图6c）。这些结果表明，改善纳米粒子在LP肿瘤中的血管渗透特性与治疗结果呈正相关，但对HP肿瘤的渗透没有明显的影响，因为这些肿瘤已经拥有高水平的被动外渗。本研究的结果表明，血管渗透性在不同的肿瘤类型和不同的血管中具有高度的异质性。这些数据显示，血管特征是决定纳米粒子通过内皮的渗透性的基本因素。然而，本研究的结果也支持这样的观点：纳米粒子的血管渗透性可以通过合理的设计来调节，特别是在LP肿瘤中实现积极的跨内皮渗透性。在这方面，本研究通过促进高尔基体依赖性的外渗途径，开发了一种跨细胞增强策略。本研究设计了具有集成溶酶体逃逸图案和HSA结合图案的蛋白质纳米颗粒，目的是通过加速高尔基体的外渗来达到减少溶酶体降解的协同效应。证据显示，提高纳米颗粒从内皮细胞中的外渗作用将是改善跨内皮运输的理想设计原则，而这对于实现肿瘤穿透和向LP肿瘤输送药物尤为重要。根据机理研究，建议从几个潜在的方面来提高LP肿瘤中纳米颗粒的血管渗透性：(1)改善纳米粒子的血液循环时间，以增加被内皮细胞捕获和吸收的机会；(2)积极加强纳米粒子与内皮细胞的相互作用以放大细胞的吸收。