作者：莱肯生物

山东农业大学和青岛清原抗性杂草防治有限公司申请的专利2022110406707（发明人：刘伟堂;王恒智;王金信;路兴涛;金涛;彭学岗;连磊）公开一种具有除草剂代谢解毒作用的基因及应用。本发明所述的基因选自CYP72A13或CYP86A2基因，这两个基因来自取除草剂代谢抗性荠菜HN31，对苯磺隆具有代谢解毒作用。

河南省农业科学院和神农种业实验室申请的专利2022112076928（发明人：张新友;石磊;黄冰艳;齐飞艳;张忠信;代小冬;秦利;刘华;韩锁义;孙子淇;董文召）涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574‑575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562‑563位发生CC→TT突变。导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸或/和Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser、Pro197Phe或Pro197Asn，获得纯合编辑突变植株，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

隆平生物技术（海南）有限公司申请的专利2022111376978（发明人：吕玉平;邸萌亮;王建海;李晓娇;王强;杨蒙迪;李涛;陈梅桂;林黎彦）公开了一种Vip3Aa截短蛋白变体及其载体和应用。根据本申请的抗虫蛋白对东方黏虫、小地老虎、斜纹夜蛾、棉铃虫、草地贪夜蛾和甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有良好抗性，尤其对小地老虎的抗性大大提高。

四川农业大学申请的专利2022110786316（发明人：涂斌;刘品;罗珊;李婷;李仕贵;陈薇兰;钦鹏;王玉平;马炳田;袁华;张晓禹;唐诗闻;康亮珠）公开了一种控制稻米品质的热激蛋白家族基因HSP110‑3及其应用。本发明中，在水稻ZH11背景下热激蛋白家族基因HSP110‑3利用CRISPR/Cas9对该基因敲除后的转基因株系与野生型水稻ZH11相比，均表现籽粒垩白粒率显著提高，揭示了热激蛋白家族基因HSP110‑3参与并调控垩白形成，是控制稻米品质的基因。

中国水稻研究所申请的专利2022116363620（发明人：魏祥进;胡培松;焦桂爱;操瑞节;唐绍清;邵高能;谢黎虹;圣忠华;胡时开;王玲）公开了控制稻米谷蛋白含量基因LGC2及其在培育低谷蛋白水稻中的应用。根据本发明LGC2基因，本发明通过基因编辑技术快速获得了2种水稻背景下的籽粒低谷蛋白的基因编辑水稻材料。此外，通过回交结合分子标记辅助选择精准的创制了其他农艺性状不变，籽粒谷蛋白降低的水稻新材料。

中国水稻研究所申请的专利202211688130X（发明人：魏祥进;胡培松;鲁菲菲;唐绍清;焦桂爱;邵高能;圣忠华;胡时开;谢黎虹;王玲;陈颖）公开了一种创制水稻高产优质的方法。系统研究发现在中花11、宁粳1号和华占背景下过表达OsHsp70‑2，可以显著提高水稻粒重及单株产量，同时在中花11背景下过表达材料的垩白粒率显著低于野生型，总淀粉、直链淀粉以及总蛋白含量均显著高于野生型。本发明发现OsHsp70‑2基因过表达后能显著提高水稻粒重、单株产量，降低稻米垩白，改良稻米品质，具有重要的育种利用价值。

浙江省农业科学院申请的专利2022108726410（发明人：郝媛媛;李春寿;赵向前;黄福灯;朱英）一种植物胶稠度相关蛋白WxGC及其编码基因与应用。本发明的WxGC蛋白可降低植物米粉胶稠度。将Wx蛋白的编码基因导入包含WxGC蛋白的胚乳粉质水稻中，可以培育胚乳透明的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

安徽农业大学申请的专利202211232107X（发明人：赵阳;马庆;路小铎;王一骁;吴红影）公开了一种具有半显性的玉米矮化相关分子标记及其应用。所述标记由玉米基因Zm00001d013465上发生的由G到A的非同义突变引起。本发明从以玉米B73为遗传背景的EMS诱变群体内鉴定到一个矮化突变体E5779，通过基因组重测序和Mutmap定位发现该突变体为Zm00001d013465基因上发生的由G到A的非同义突变引起。E5779突变体株高、穗位高显著降低，具有半显性特点，可显著降低F1代植株的高度，并由此开发了分子标记，对E5779的分析和利用有助于改良玉米株高和耐密育种。

中国农业大学申请的专利2022112633832（发明人：潘清春;陈范骏;米国华）提供编辑玉米硝酸盐转运体基因ZmNRT1·5的三个编辑靶点，利用三个编辑靶点可以对ZmNRT1·5基因进行编辑，获得单个或多个碱基插入、缺失或大片段缺失等编辑类型，为深入解析该基因功能提供遗传材料。

西北农林科技大学申请的专利2022115412460（发明人：赵天永;刘应）公开了玉米ZmRAFS基因用于提高玉米耐储藏能力的应用。本发明通过在玉米中超表达ZmRAFS基因，提高了玉米的耐储藏能力。

西南大学申请的专利2022116407474（发明人：杨宇衡;刘赛斐;陈安乐;田斌年;方安菲;余洋;毕朝位）公开了玉米ZmlecRK‑G2基因及其应用。ZmLecRK‑G2蛋白的胞外Lectin结构域具有结合β‑葡聚糖的能力，玉米ZmLecRK‑G2突变体对玉米南方锈病更加敏感，同时ZmLecRK‑G2基因瞬时表达可以提高本氏烟对核盘菌抗性。

四川农业大学申请的专利2022108188437（发明人：卢艳丽;徐洁;刘天红;唐鑫;蒲雪梅;刘彦君;吴锋锴;汪青军;冯宣军）公开了玉米干旱响应基因miR528b启动子的Indel标记及其应用。本发明提供的Indel标记在干旱条件下与玉米材料的存活率显著相关，该Indel标记可以增强玉米材料的耐旱性，进而提高干旱后玉米植株存活率。

华中农业大学申请的专利2022109975410（发明人：邱法展;王伟;龚佃明;孙琴）提供了一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用，属于分子标记技术领域。本发明以田间自然突变体wil2和自交系材料B73杂交，后代自交构建的F2群体为材料，开发得到一种位于2号染色体上的与候选耐高温基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记与玉米高温响应紧密连锁，可用于筛选耐高温性状玉米或辅助分子育种。

中国农业大学申请的专利2022115621860（发明人：张静;贾冠南;陈国经纬）公开了一种玉米氮高效利用基因ZmNCRG1、及其分子标记和应用。本发明在此氮高效利用基因内，鉴定了一个在抗感材料间存在差异的插入缺失标记。该标记与玉米氮高效利用连锁，可作为玉米氮高效利用分子标记。

青岛农业大学申请的专利2022110727784（发明人：郭卫卫;齐彤;张玉梅;贺子涵;刘文筱;李夕梅;王会芳）公开了小麦TaCBF14B基因的新用途。在耐旱基因筛选过程中，本发明发现，小麦TaCBF14B基因具有耐旱功能，将该基因导入目的植物中，可以显著提高其抗旱性。

山东大学申请的专利2022115196673（发明人：白明义;牟俊仪;樊敏;李根英;韩超）公开了一种利用基因编辑敲除TaSnRK2.10增加小麦分蘖数、穗粒数和籽粒宽度的应用。

中国农业科学院作物科学研究所申请的专利2022116199005（发明人：李立会;张智;周升辉;刘伟华;宋利强;张锦鹏;韩海明;杨欣明;李秀全）公开了SRRP3及其在提高植物抗病性中的应用。实验结果表明，SRRP3转基因植物对小麦条锈病条中32生理小种表现高抗，说明SRRP3及其编码基因可以提高小麦的条锈病条中32生理小种的抗病性，可用于植物育种。

四川农业大学申请的专利2022111444481（发明人：马建;周界光;李伟;陈黄鑫;赵聪豪;刘航;张智源;刘燕林;唐华苹;江千涛;蒋云峰;唐力为;魏育明）公开了一种与小麦小穗数QTL连锁的SNP分子标记及其应用。所述KASP‑3D‑1分子标记为SNP分子标记，多态性为G/A，其与所述小麦小穗数QTL QSns.sau‑MC‑3D.1共定位于小麦3D染色体短臂上。本发明提供的分子标记KASP‑3D‑1与小麦3D上的小穗数QTL QSns.sau‑MC‑3D.1紧密连锁，可用来对小麦小穗数这一性状进行定位。

山东农业大学申请的专利2021110646053（发明人：吴佳洁;李明凯;朱芮娴;刘涵;李金龙;倪飞;付道林）公开了小麦抗叶锈病基因Lr29的分子标记XsdauLH3388和Xsdau19A20A及其应用。本发明的分子标记XsdauLH3388为共显性的InDel标记；分子标记Xsdau19A20A为共显性的CAPS标记。利用分子标记XsdauLH3388或Xsdau19A20A可以检测小麦抗叶锈病基因Lr29以及含有Lr29基因的植株基因型。

江苏省农业科学院申请的专利2022110201694（发明人：姜朋;张旭;吴磊;何漪;李畅）公开一组小麦株高主效基因的多重KASP标记引物组，该多重KASP标记引物组可以同时检测小麦的Rht‑B1和Rht‑D1基因。

先锋国际良种公司和纳幕尔杜邦公司申请的专利2023100102235（发明人：A.C.克劳;S.H.迪恩;A.L.卢;C.R.西蒙斯;L.E.斯姆斯）涉及植物调节元件及其使用方法。具体为来源于紫茉莉属（Mirabilis）花叶病毒中的增强子。

武汉大学申请的专利2022113692912（发明人：殷雷;周进;王宏健;陈鹏;刘欢;方嘉凌）公开了一种紧凑型编辑工具EbCas12a在基因编辑中的应用。本发明首次在Erysipelotrichia bacterium菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型更小的CRISPR蛋白EbCas12a（1158AA），比目前报道的具有基因编辑功能的Cas12a均要小；所述EbCas12a能够在crRNA的介导下定点对体外DNA和真核生物基因组进行基因编辑。EbCas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类。

中国科学院广州生物医药与健康研究院申请的专利（发明人：赖良学;吴涵;陈方兵;连萌）公开了一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用。所述Cas12a蛋白突变体在dLbCas12a蛋白基础上发生D156R、G532R和K538R组合突变，G532R和K595R组合突变或G532R、K538V和Y542R组合突变中的任意一种或至少两种的组合。本发明以dLbCas12a为基础进行改造，获得了识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体，并构建了可识别PAM范围拓宽的高效碱基编辑器，该碱基编辑器在细胞与胚胎水平上均能对经典PAM和非经典PAM实现高效的C>T或A>G编辑；且能够在细胞与胚胎水平实现同时多位点高效的C>T或A>G编辑，成功地丰富了现有的碱基编辑工具箱。

佐治亚大学研究基金会股份有限公司和冷泉港实验室申请的专利202180041377X（发明人：R·凯利·道恩;戴维·杰克逊）涉及杂合的CENH3单子叶植物及其用于单倍体诱导和同时基因组编辑的方法。

单子叶单倍体诱导物植物通常由只有一个编码功能性CENH3蛋白的等位基因的二倍体植物细胞组成。二倍体植物细胞还可以包括例如一个编码非功能性CENH3蛋白的CenH3等位基因。在一些实施方案中，编码非功能性CENH3蛋白的等位基因是移码突变、蛋白无效等位基因、RNA无效等位基因或其组合。单子叶单倍体诱导物植物还可以包括基因编辑机器，例如由单子叶植物细胞稳定表达的定点核酸酶和任选地指导RNA。还提供了诱导靶标单倍体单子叶植物形成而任选地同时修饰靶标单子叶植物基因组的方法。

青岛农业大学申请的专利2022114576340（发明人：隋炯明;林顺钰;张恒;王晶珊;禹山林;朱虹;马涛;于恺悦;乔利仙;赵春梅）公开了花生FUS3基因和启动子及其在提高花生含油量和耐盐性中的应用。花生FUS3启动子能够更加高效地启动基因转录和表达。将该启动子与花生FUS3基因配合，可显著提高植物的含油量和耐盐性能。

浙江大学申请的专利2023100548532（发明人：张天真;李宜谦;史卓琳;司占峰;方磊）公开了一个同时改良棉花纤维长度、强度、伸长率的ROPGEF基因及其应用。基因GHLSF的基因组序列包含一个碱基C的删除，位于基因组序列的1988‑1990bp位置处，该位点原有的碱基的缺失导致对应的蛋白质提前终止。其中，单倍型TCA的棉花品种（系）的纤维品质显著优于单倍型TCC的棉花材料。

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所申请的专利2023100774942（发明人：王雪;康俊梅;李明娜;龙瑞才;陈林;王珍;杨青川）公开了一种UGT84A1基因在调控花青素合成方面的应用。包括使UGT84A1基因的功能丧失使花青素含量减少，或使UGT84A1基因过表达使花青素含量升高。本发明利用UGT84A1基因来控制植物体中花青素的合成，为提高牧草花青素含量从而改良牧草品质提供了有力的技术支持。

陶氏益农公司申请的专利2013800170311《植物反式激活互作基序及其用途》（发明人：J·皮托利诺；J·李；S·L·伊文思；R·C·布卢）经实质审查后于2016年05月03日以权利要求1-4、6-41不符合专利法第26条第4款的规定为由被驳回。申请人于2016年08月18日向专利复审委员会提出了复审请求。合议组经过审查，做出了撤销原驳回决定的审查决定。今天，就让我们详细看看这个专利。

本发明提供一种包含DNA结合多肽和植物反式激活结构域互作基序多肽的转录激活物融合蛋白，用来对基因表达进行调控、以增加感兴趣基因的转录，从而提高其表达。

国家知识产权局原审查部门于2016年05月03日以权利要求1-4、6-41不符合专利法第26条第4款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所针对的权利要求1如下：

“1. 一种人造转录激活物融合蛋白，其包含：DNA结合多肽，其特异性结合与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的DNA启动子；和(i)与选自SEQ ID NO:10-16的氨基酸序列具有至少90%同一性的反式激活结构域互作基序(TAD)多肽，或(ii)在选自SEQ ID NO:10-16的氨基酸序列中有一个或数个氨基酸取代、缺失或添加的变体TAD，其中该变体TAD与所述氨基酸序列至少90%相同，且该变体TAD当所述DNA结合多肽结合所述DNA启动子时起始所述感兴趣的多核苷酸的转录或提高其转录速率。”

驳回决定认为：权利要求1请求保护一种人造转录激活物融合蛋白，其利用“(i)与选自SEQ ID NO:10-16的氨基酸序列具有至少90%同一性的反式激活结构域互作基序（TAD）多肽，或(ii)在选自SEQ ID NO:10-16的氨基酸序列中有一个或数个氨基酸取代、缺失或添加的变体TAD，其中该变体TAD与所述氨基酸序列至少90%相同”来对衍生的变体TAD进行限定。但是由本申请说明书记载内容可知，上述形式限定的人工修饰反式激活结构域互作基序的技术效果难以事先预测，需要实验加以证明。在本申请仅能获知天然存在的被发现的“SEQ ID NO:10-16”具有TAD的功能情况下，本领域技术人员很难预期哪些衍生的变体TAD具有SEQ ID NO:10-16所示TAD的功能。因此，权利要求1得不到说明书的支持，不符合专利法第26条第4款的规定。

申请人陶氏益农公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2016年08月18日向国家知识产权局提出了复审请求，并修改了权利要求书：

将原权利要求1的融合蛋白具体限定为“(i)包含选自SEQ ID NO:2-8、10-16、80-86和100-106的氨基酸序列的反式激活结构域互作基序多肽，或(ii)包含选自SEQ ID NO:17-58、87-93和107-127的氨基酸序列的变体反式激活结构域互作基序多肽”。

结合上述修改，复审请求人认为：驳回决定认为本申请的权利要求中“同一性/取代、缺失或添加”的方式得不到说明书支持。修改后的权利要求删除了这些表述，并在权利要求中用序列号来表征反式激活结构域互作基序或其变体，驳回决定所依据的理由已经不存在相关的事实基础。因此，修改后权利要求1-41符合专利法第26条第4款的规定。

经形式审查合格，国家知识产权局于2016年09月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。

原审查部门在前置审查意见书中认为：修改后的SEQ ID NO:17-58等序列也都是变体序列，同样得不到说明书的支持，坚持原驳回决定。

随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。

合议组于2017年02月23日向复审请求人发出复审通知书，指出：

对于权利要求1中所述的SEQ ID NO:2-8、10-16、80-86和100-106以及SEQ ID NO:17-58、87-93和107-127的TAD互作基序多肽来说，本申请说明书实施例中仅对核苷酸序列SEQ ID NO:80-93所编码表达得到的TAD互作基序即氨基酸序列为SEQ ID NO:2-8、108、110、112、114、116、118和120的TAD互作基序序列给予了效果验证，对于其他的TAD互作基序则没有进行效果记载；且根据其效果可知涉及SEQ ID NO:5和120的技术方案包含了无法达到本申请所述技术效果的情况。由于不同氨基酸序列结构的TAD互作基序对于基因的转录激活作用都不相同，因而仅根据说明书中验证的特定的实例，本领域技术人员无法预期包含权利要求1概括范围内任意的TAD互作基序多肽的融合蛋白都能够达到本申请所述的技术效果。

针对复审通知书，复审请求人多次修改权利要求，最终将权利要求1修改如下：

“1. 一种人造转录激活物融合蛋白，其包含：DNA结合多肽，其特异性结合与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的DNA启动子；和(i)包含选自SEQ ID NO:2-4和6-8的氨基酸序列的反式激活结构域互作基序多肽，或(ii)包含选自SEQ ID NO:108、110、112、114、116和118的氨基酸序列的变体反式激活结构域互作基序多肽。”

在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。

专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，清楚、简要地限定要求专利保护的范围。如果权利要求的概括包含推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，则这种概括得不到说明书的支持。如果通过修改删除了上述内容，并且其保护范围未超出原申请文件记载的范围，则该权利要求的修改克服了得不到说明书支持的缺陷。

具体到本申请，权利要求1要求保护一种人造转录激活物融合蛋白，其包含：DNA结合多肽，其特异性结合与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的DNA启动子；和(i)包含选自SEQ ID NO:2-4和6-8的氨基酸序列的反式激活结构域互作基序多肽，或(ii)包含选自SEQ ID NO:108、110、112、114、116和118的氨基酸序列的变体反式激活结构域互作基序多肽。

驳回决定和前置审查意见书中认为：权利要求1请求保护的人造转录激活物融合蛋白利用了同一性、取代、缺失或添加的变体、至少90%相同的方式来限定衍生的变体TAD，在本申请仅能获知天然存在的被发现的“SEQ ID NO:10-16”具有TAD的功能情况下，本领域技术人员无法预期哪些衍生的变体TAD具有SEQ ID NO:10-16所示TAD的功能，权利要求1概括了较大的范围，得不到说明书的支持。

复审请求人于2017年05月11日修改了权利要求，对权利要求1中反式激活结构域互作基序多肽的氨基酸序列作了具体限定，将所述的寡核苷酸限定为说明书已经验证了活性的序列SEQ ID NO:2-4、6-8以及108、110、112、114、116和118。根据本申请说明书的记载，本申请的发明目的在于提供一种包含DNA结合多肽和植物反式激活结构域互作基序多肽的转录激活物融合蛋白，用来对基因表达进行调控、以增加感兴趣的基因的转录从而引发/增强其表达。其中的反式激活结构域互作基序多肽或其变体即是从植物反式激活物蛋白质中分离得到的反式激活结构域（TAD）蛋白质-蛋白质互作基序或其变体形式，所述互作基序可以用在人造的TAD中为包含该TAD的多肽提供基因调节性能。本申请说明书实施例1中记载了TAD互作基序即SEQ ID NO:2-8的获得与鉴定。实施例2记载了对鉴定得到的TAD互作基序的修饰方法以及获得的变体。实施例3-6则针对所获得的TAD互作基序及其部分的具体变体形式分别在酿酒酵母报告菌株中、在烟草中进行功能效果验证。其中实施例3明确记载了所进行效果验证的表达盒中包含有SEQ ID NO:80-93中描述的天然和变体TAD互作基序的核苷酸序列，即对核苷酸序列SEQ ID NO:80-93所编码表达得到的TAD互作基序即氨基酸序列为SEQ ID NO:2-8、108、110、112、114、116、118和120的TAD互作基序序列给予了效果验证。具体为：与VP16对照相比，经过修饰的ERF2(v2)TAD互作基序（对应于SEQ ID NO:108）产生了MEL1蛋白质较高水平的表达；经过修饰的PTI4(v2)TAD互作基序（对应于SEQ ID NO:110）表达的MEL1蛋白质与VP16反式激活结构域对照相似。其中Erf2(v3)（对应于SEQ ID NO:2）、Pti4v(v3)（对应于SEQ ID NO:3）、AtERF1(v3)（对应于SEQ ID NO:4）、AtERF1(v2)（对应于SEQ ID NO:112）、ORCA2(v2)（对应于SEQ ID NO:114）、DOF1(v3)（对应于SEQ ID NO:8）、DREB1A(v3)（对应于SEQ ID NO:6）、DREB1A(v2)（对应于SEQ ID NO:116）、CBF1(v3)（对应于SEQ ID NO:7）和CBF1(v2)（对应于SEQ ID NO:118）TAD互作基序在酵母测定中相比VP16对照虽没有造成高水平的Mel1表达，但是可以满足能够引发表达的需求。由此可见，本申请说明书证明了SEQ ID NO: 2-4、6-8、108、110、112、114、116、118和120的TAD互作基序序列能够获得预期的技术效果。因此，修改后的权利要求1能够得到说明书的支持，符合专利法第26条第4款的规定。

基于以上事实和理由，合议组作出撤销国家知识产权局于2016年05月03日对本申请作出的驳回决定的审查决定。

蛋白质特定的结构和功能是由其一级结构氨基酸序列所决定的。不同氨基酸序列的变体会影响蛋白的各级结构，从而改变相应蛋白的功能和效果。

本案中，原权利要求1申请保护人造转录激活物融合蛋白TDA多肽及其变体时存在“90%同一性/取代、缺失或添加”的模糊表述，涵盖了大量未经说明书实施例加以效果验证的蛋白变体，这些变体蛋白的结构和功能是无法预知的，所以原权利要求得不到说明书的支持。申请人经过修改，将权利要求中反式激活结构域（TAD）互作基序多肽的氨基酸序列作了具体限定，这些TAD互作基序多肽的功能效果验证在说明书中有明确的记载，已证明能够获得预期的技术效果。因此，修改后的权利要求得到了说明书的支持。