日期：
2023-05-02 06:03:53
来源：BioArt收集 编辑：亦
撰文丨亦
中枢神经系统 （central nervous system, CNS ）中细胞间的互作在神经系统疾病中发挥着重要作用，但受限于系统鉴定方法的缺乏，其具体涉及的分子途径依然是个谜题。多发性硬化症 （multiple sclerosis, MS ）是CNS的慢性炎症性疾病【1】 ，以往研究表明，CNS驻留的胶质细胞间的互作在MS中发挥作用【2-3】 ，识别星形胶质细胞-小胶质细胞的互作对于鉴定神经系统疾病潜在药物靶点十分重要。正向遗传学筛选平台是鉴定生物学相关基因的有力手段，但受限于高通量的共培养和扰动单细胞的筛选，其在细胞间互作上的应用还不是很广泛。近日，来自哈佛医学院神经疾病中心的Francisco J. Quintana 团队在Science Droplet-based forward genetic screening of astrocyte–microglia cross-talk 建立了一个正向遗传筛选平台，该平台结合CRISPR-Cas9干扰，细胞共培养和基于微流体的荧光激活液滴分选，实现对细胞-细胞间通讯机制的解析 。作者开发了SPEAC-seq并将其与体内遗传扰动相结合，发现在多发性硬化症中，胶质细胞产生的双调蛋白对促进疾病的星形胶质细胞响应具有抑制作用。 为建立研究细胞间互作的液滴微流控平台，作者对细胞培养基进行优化以提升液滴稳定性，并产生含有细胞对的皮升级别的油包水液滴，再经过三色定制的液滴细胞测量系统进行荧光检测，最后用电泳实现细胞对的分离（图1） 。经过验证，该平台能够通过荧光染料多重标记，检测到液滴中星形胶质细胞和培养基中小胶质细胞的互作，也能够应用于同一液滴中共培养的细胞对相互作用检测，如其中一个细胞产生的诱导因子（cues）对另一个细胞状态的影响。 接下来，作者将液滴共培养系统与CRISPR-Cas9干扰相结合建立了SPEAC-seq（图2） 。他们分别将星形胶质细胞与对照培养基、LPS激活的巨噬细胞和转染了非靶向慢病毒CRISPR-Cas9载体的小胶质细胞共培养，测序结果显示，小胶质因子参与对星形胶质细胞NF-kB激活的抑制。随后作者对小鼠小胶质细胞进行了基因组层面CRISPR-Cas9文库的转染并使用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞，将其与含NF-kB报告子的星形胶质细胞共包埋至液滴，筛选出小胶质细胞和EGFP+星形胶质细胞的活细胞对，经过筛选过滤，作者得到了1061个候选分子。为识别出抑制促炎星形胶质细胞响应的小胶质因子，作者分析了小胶质细胞的分泌因子并找到了4个候选，分别是Areg , Nrtn , Fgl1 ,和Pnoc， 其对应星形胶质细胞上的四个独立受体Egfr , Lag3 , Gfra2 , Oprl1 。 图2 SPEAC-seq鉴定小胶质细胞与星形胶质细胞互作 进一步地，作者通过体内细胞类型特异性Perturb-seq，设计了靶向不同受体的sgRNAs，发现针对Egfr 的效果显著，其在星形胶质细胞中表达显著高于小胶质细胞，免疫染色也验证了这一点，说明AREG-EGFR信号通路在小胶质细胞-星形胶质细胞互作中发挥作用。接下里，作者在体内外对星形胶质细胞进行AREG处理，发现在实验性自身免疫性脑脊髓炎 （experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE ）和潜在的MS中，小胶质的AREG通过EGFR抑制星形胶质细胞的致病活性。 那么小胶质细胞的Areg 又是由什么诱导产生的呢？以往研究显示IL-33可抑制EAE同时诱导Areg 表达，RABID-seq数据库提示星形胶质细胞来源的IL-33可能是Areg+ 小胶质细胞的上游调节子，体内外实验均证实了这一点，星形胶质细胞产生的IL-33诱导ST2+小胶质细胞中AREG的表达，形成调节反馈环路。类似地，MS病人中星形胶质细胞IL-33的增加会通过ST2信号通路诱发小胶质细胞中AREG的表达，从而限制促疾病的星形胶质细胞活性。 综上，文章报道了一个能对细胞间互作机制进行正向遗传筛选的高通量平台，主要涉及细胞的系统扰动和SPEAC-seq测序，提出SPEAC-seq能够作为细胞-细胞间通讯机制的高通量系统鉴定方法。 原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq4822
制版人：十一
1. D. S. Reich, C. F. Lucchinetti, P. A. Calabresi, N. Engl. J. Med. 2. R. T. Han, R. D. Kim, A. V. Molofsky, S. A. Liddelow, Immunity 3. M. Linnerbauer, M. A. Wheeler, F. J. Quintana, Neuron 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。