#肿瘤免疫治疗#

免疫疗法可以通过刺激患者自身的免疫系统特异性地杀死癌细胞，这显著地改善了癌症患者的治疗效果。越来越多的证据表明，长链非编码RNA (lncRNA) 在癌症等多种疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用。LncRNA可以调节各种细胞功能，如细胞分化、细胞增殖和不同类型免疫细胞的激活。然而，大多数长链非编码RNA的功能及其在肿瘤免疫中的作用仍然未知。

高通量 CRISPR 筛选可以对参与调节癌症发展、转移和耐药的基因进行功能识别。一些基于功能丧失 (loss of function) 的 CRISPR 筛选研究可以识别调控细胞存活的必需基因。然而，lncRNA通常有非常低的基础水平表达。对已经低表达的 lncRNA 的CRSIPR敲除会降低筛选的能力。此外，lncRNA对错义和移码突变不敏感，因此很难被传统的CRISPR-Cas9系统功能性敲除。这些特性极大地限制了 lncRNA 功能丧失筛选的灵敏度和特异性。最近开发的 CRISPR 激活 (CRISPR-SAM) 技术可以通过靶向启动子区域来激活基因表达。激活的转录本会经历类似的内源性转录后修饰，导致相对“生理”水平的过表达。因此，CRISPR-SAM 技术提供了一个可以系统地识别调控肿瘤免疫反应的lncRNA的平台。

近日，匹兹堡大学杨达课题组在Science Advances上发表了题为Genome-wide gain-of-function screening characterized lncRNA regulators for tumor immune response的论文。该文首次在对9744 个lncRNA在肿瘤免疫的调节功能进行了 CRISPR 激活筛选，并确定了两组可能在不同方向上调节肿瘤免疫反应的 lncRNA（抑制和促进）。进一步分析肿瘤免疫基因组学数据库表明，两个靶点 IL10RB-DT 和 LINC01198 与黑色素瘤和乳腺癌的肿瘤免疫反应和生存显著相关。使用肿瘤免疫基因组学数据的分析表明，CRISPRa 筛选出的 lncRNA 与肿瘤免疫特征、T细胞浸润、黑色素瘤和乳腺癌的存活率以及黑色素瘤患者的免疫检查点阻断（ICB）治疗反应显著相关，这为临床上肿瘤免疫疗法提供了新的思路。

为了识别调节肿瘤细胞与细胞毒性T细胞相互作用的 lncRNA，作者首先使用了原代CD8+ T 细胞和黑色素瘤细胞共培养系统 （如图1所示）。由于gp100抗原可以以HLA-A*02的特异性方式呈现在黑色素瘤细胞系MEL-526表面，原代CD8+ T 细胞被转导了一种特定的可以识别人类 gp100抗原的TCR。CD8+ T细胞在T细胞受体 (TCR) 识别主要组织相容性复合体 I 类 (MHC-I) 分子上呈递的肿瘤新抗原后被激活，从而杀死癌细胞。

然后，作者在 MEL-526 细胞中建立了 CRISPR-SAM 系统，并使用全基因组 CRISPRa 文库转导细胞，其中包括 96,458 个靶向 lncRNA 转录起始位点 (TSS) 的单向导RNA (sgRNA)。通过 GENCODE v19的注释，文库包含500个对照sgRNA 和靶向 9744 个lncRNA的 sgRNA，其中包括 4446 个基因间lncRNA 和 1533 个反义 lncRNA。

图1：利用肿瘤细胞和T细胞共培养系统的 CRISPRa 筛选流程图

在CRISPRa全基因组筛选lncRNA的基础上，作者进一步整合了与TCGA癌症数据库中肿瘤免疫基因组数据来识别在癌症病人中能真正起到免疫调节的lncRNA基因。通过这项研究，作者找到了IL10RB-DT为一种可导致肿瘤免疫抑制的基因。IL10RB-DT表达与 472 名黑色素瘤患者的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 和 568 名甲状腺癌患者的 CD8/CD68 表达呈负相关。IL10RB-DT 的表达也与乳腺癌患者的低生存率显著相关。此外，进一步的共培养验证表明，IL10RB-DT 在肿瘤细胞中的激活抑制了 CD8+ T 细胞的激活并诱导其衰竭。另一方面，RNA-seq 分析和其他研究表明 IL10RB-DT 通过 IFN-γ-JAK-STAT1 信号传导抑制肿瘤抗原呈递。

从筛选结果中，作者还确定了LINC01198为一个可以使肿瘤细胞对免疫治疗敏感的lncRNA。作者发现，与正常组织样本相比，LINC01198 在包括乳腺癌、结肠腺癌和前列腺癌多种癌症类型中受到显著抑制。具有较高LINC01198 表达的乳腺癌患者往往具有较好的免疫反应，表现为较高的 CD8、IL2、IL8 和 IL12 免疫特征评分。作者将人 CD8+ T 细胞与 LINC01198激活的MEL-526细胞共培养显示在两个时间点均可以显著促进 CD8+ T 细胞的活化水平和细胞因子分泌水平。后续的实验研究和 RNA-seq 分析表明，LINC01198 介导的I型和II型干扰素通路的激活可能有助于其免疫促进功能。作者进一步对LINC01198激活的MCF-7 和 MEL-526 细胞进行了 RNA-seq分析。通路分析表明，LINC01198 可以上调NF-κB下游靶标基因。Rescue experiment, luciferase reporter assay和 ChIP-qPCR 结果表明，LINC01198 的上调显著诱导了p65 与其靶基因启动子的结合，并表明 LINC01198 的免疫调节功能依赖于 p65 (如图2所示)。

图2：LncRNA LINC01198 在肿瘤细胞中对免疫反应的调节机制模型

在绝大多数 lncRNA 的功能仍然未知的情况下，全基因组 CRISPR 筛选将成为识别这些新基因的绝佳平台。然而，由于 lncRNA 的低表达水平和非编码性质，lncRNA的全基因组功能筛选尚未获得突破。在这项研究中，作者进行了系统的功能获得 （gain of function）筛选，并确定了在肿瘤和细胞毒性T细胞相互作用中起关键作用的lncRNA。sgRNA文库在激活lncRNA的同时也激活了1259个蛋白质编码基因，作者利用CRISPRa 筛选也可以成功地识别出已报道可调节肿瘤免疫的ULK1基因。作者同时在功能上识别了可调节肿瘤免疫反应的lncRNA IL10RB-DT 和 LINC001198，它们通过抑制 I/II 型 IFN 通路来调节 T 细胞活化。作者进一步通过实验证明 lncRNA LINC01198 通过激活 NF-κB 成分 p65 来促进免疫反应。

在 CRISPRa 出现之前，大多数 lncRNA 功能获得研究都依赖于基于质粒的过表达。这些研究通常将lncRNAs的cDNA序列插入带有人工启动子的质粒中，以实现异位过表达。然而，lncRNA mRNA 的剪接非常复杂，会产生比蛋白质编码基因多得多的同种型转录物。如今，即使进行了 ENCODE 等测序工作，大多数 lncRNA的cDNA 序列仍未得到很好的确定。单个 lncRNA 基因的功能获得研究仍然是繁琐的工作，更不用说全基因组功能获得筛选了。CRISPR-SAM技术的发明在很大程度上缓解了这个问题。因为过表达的lncRNA产物可以经过内源性转录后加工，折叠成合适的二级结构。正如作者在验证中所示，靶向两个lncRNA转录起始位点的sgRNA可以实现 lncRNA 的生理上调，这在很大程度上有助于识别它们在肿瘤免疫调节中的作用。

匹兹堡大学博士生王艺霏、赵月珊，博士后郭纬纬，为本文共同第一作者。匹兹堡大学杨达和张敏为本文共同通讯作者。匹兹堡大学杨达教授利用生物信息结合生物学实验来开发癌症的精准治疗和新疗法。有意向的同学可联系申请博士和博士后。

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https://jinshuju.net/f/ZqXwZt

原文链接：

http://doi.org/10.1126/sciadv.add000

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