撰文 | Enigma

#基因治疗#

工程化T细胞正在临床中显示与日俱增的影响力。目前，已有五种使用嵌合抗原受体 (CAR) T细胞的方案获批应用于不同的B细胞恶性肿瘤治疗中。此外，针对不同适应症的多达数百个临床试验正在进行中，这些试验采用不同的CAR变体或工程化的T细胞受体（TCR），以提高疗效、安全性和可扩展性。重要的是，已获准的CAR-T疗法都需要繁琐、昂贵和耗时的自体T细胞操作。因此，目前针对同种异体CAR/TCR T细胞产品的开发引人关注。在这种方法中，需要破坏工程化的同种异体T细胞的内源性TCR，以防止移植物抗宿主病，这通常是通过位点特异性核酸酶如megaTALs和CRISPR-Cas9实现。切割TCR位点可进一步促进CAR和工程化TCR基因的直接整合，利于统一表达，增强T细胞的潜能和延迟衰竭。此外，TCR链之外的其它基因可能会被破坏，以改善T细胞功能，带来耐药性或避免检查点抑制等。

位点特异性核酸酶虽然非常有效，但它也可能带来负面的结果。比如，Cas9在体内具有免疫原性，可引起体液和细胞反应。最新研究还发现，Cas9可激活p53通路并选择p53失活突变。另外，脱靶切割无法完全避免，小的靶上插入和缺失也较为常见，即使加入基因校正或插入的供体模板也是如此。重要的是，CRISPR-Cas9切割还会导致严重的染色体畸变。在美国首个涉及CRISPR-Cas9的临床试验中，Stadtmauer等人在干扰TCR和程序性细胞死亡蛋白1（PDCD1）以进行异体T细胞治疗时，报道了在给药后，患者体内染色体易位频率随时间推移下降。

近日，以色列特拉维夫大学的Adi Barzel课题组在Nature Biotechnology发表了题为Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage的研究论文。他们采用与Stadtmauer等人相同的引导RNA序列，用CRISPR-Cas9靶向人原代T细胞中的TCR和PDCD1位点。通过采用一种基于单细胞RNA测序 (scRNA-seq)、荧光原位杂交 (FISH) 和微滴式PCR (ddPCR) 分析的新型无偏方法，他们在含有目标位点的染色体上检测到了频繁的非整倍体和截断。

作者猜测，由位点特异性核酸酶诱导的双链DNA断裂，可能会由于DNA修复失败而导致染色体截断和非整倍体。他们进而推测，通过跟踪染色体上基因表达的整体变化可以检测和监测这种不良后果。为了在临床相关环境中分析染色体截断和非整倍性，作者首先使用一个靶向TCRα位点的单链向导RNA (gRNA) 将CRISPR-Cas9核糖核蛋白(RNP) 电穿孔到原代人T细胞。他们采用与Stadtmauer等人相同的gRNA，作为对照还采用了一个不相关的gRNA（在人体基因组中没有匹配靶标）。转染4天后，他们对样品进行scRNA-seq，发现TCRα转录下调，并利用细胞转录情况来推断拷贝数变化。在TCRα靶向样本中，多达5.3%的细胞表达模式发生14号染色体缺失。除此之外，这些细胞中14号染色体在未检测到表达的基因平均数量中表现为极端异常值。值得注意的是，TCR位点的14号染色体长臂截断在功能上相当整个染色体的非整数倍体，因为14号染色体上几乎整个编码蛋白的基因都在TCRα位点远端的长臂上。有趣的是，大概0.5-0.9%的细胞出现了明显的14号染色体增加，这可能是由于近端着丝粒长臂的误分离引起的。在14号染色体缺失或增加的细胞中，有100个14号染色体基因被低表达，107个14号染色体基因 (在T细胞中表达的270个14号染色体基因中) 过表达。

作者在14号染色体近端、远端分别标记红色和绿色信号，用FISH试验进一步证实了scRNA-seq结果的可靠性。他们发现，在三个独立的FISH迭代中，TCRα靶向细胞中显示出的非整倍性信号模式明显多于对照组细胞，与scRNA-seq分析结果一致。采用ddPCR可观察14号染色体断裂的过程。通过收集CRISPR-Cas9 RNA电穿孔后不同时间点的DNA，以评估断裂点发生的动态过程，他们发现了与scRNA-seq和FISH相一致的结果。作者还采用T分布随机邻域嵌入 (tSNE) 分析来根据T细胞的转录特征聚集T细胞，发现不同组之间分布相似。但基因集富集分析（GSEA）检测到组间整体基因表达模式的显著差异。具体说，在14号染色体缺失或增加的T细胞中富集的转录特征反映了与细胞周期和各种代谢途径相关的基因表达减少，以及与p53途径激活和凋亡相关的基因表达增加。此外，与正常细胞相比，14号染色体缺失的细胞中处于G1期的比例更大。作者发现，延长T细胞的培养可以降低移植非整数倍体细胞风险，但需要额外的缓解措施。而采用多个向导RNA靶向不同位点引起染色体异常的风险更大。

综上所述，作者发现在CRISPR-Cas9切割中，不同的核酸酶和gRNA引起高频率的染色体异常现象，包括非整数倍体和截断。考虑到非整数倍体等在不同癌症中的关系，作者为了CRISPR-Cas9基因编辑在临床试验中的应用敲响了警钟。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01377-0

想了解更多精彩内容，快来关注BioArt生物艺术