撰文 | 咸姐
细胞通过分泌蛋白质来向邻近的细胞或远处的组织发送信息，以此介导各个组织器官间的相互作用，其中能量平衡系统具有高度整合性，肌细胞因子和脂肪因子在其中扮演着重要的角色。而这些分泌因子发挥的作用是好是坏则取决于它们的浓度、组织和环境，而且受到各种刺激的影响，如寒冷或运动【1,2】。识别潜在的有益分泌蛋白无疑具有非常重要的意义。然而，目前基于此目的的一些方法都具有较大的局限性。例如，对组织的转录组学或蛋白质组学特征的计算分析可能会遗漏许多分泌蛋白，因为很多分泌的变化并不伴随mRNA水平的变化，并且一些分泌/脱落是非典型的过程。再比如血清或血浆蛋白质组学分析作为目前更常用的鉴定新分泌蛋白的方法，也受到血清或血浆中高丰度蛋白质的影响，而严重限制了低丰度蛋白质的检测，即所谓的动态范围问题。即使质谱（MS）技术日益精进，但其覆盖率仍然很低，发现潜在重要分子仍然是不太可能的，或者需要对初始样品进行复杂的处理、需要大量的MS仪器时间和/或基因修饰。尽管如此，新型分泌蛋白的鉴定也不是毫无办法。细胞外液（EF），不仅含有营养物质，还含有分泌蛋白和代谢物等信号分子，对皮肤EF的研究表明，在血清中能检测到的83%的蛋白质也可以在EF中检测到，而皮肤EF蛋白质的50%都无法在血清中检测到，由此可见，EF或许可以作为新的细胞外和生物活性蛋白鉴定的来源。
2023年1月20日，来自美国丹娜·法伯癌症研究所的Bruce M. Spiegelman团队在Cell Metabolism上在线发表题为Isolation of extracellular fluids reveals novel secreted bioactive proteins from muscle and fat tissues 的文章，开发了一种快速分离细胞外液的蛋白质组学方法，以鉴定肌肉和脂肪中的新分泌蛋白，与血浆蛋白质组相比，该方法具有更高的蛋白质覆盖率。利用该方法可以在运动、Pgc1α表达或寒冷暴露条件下定量许多潜在的新型肌细胞因子和脂肪因子，并且首次确定鞘脂激活蛋白原 (Prosaposin) 为新的肌肉和脂肪的分泌产物。
研究人员首先采用了已有技术来分析肌肉EF中的代谢物，以表征EF的组成（包括来自肌肉组织的潜在的新分泌蛋白），发现肌肉EF的蛋白质模式与肌肉组织、血清和血浆均不同，对血清和血浆MS分析造成巨大障碍的大量高丰度蛋白质（如白蛋白和IGG）在EF中明显减少，但是肌肉EF中仍有大量白蛋白。因此，研究人员又在此基础上加入了去除白蛋白的步骤，从而增加了MS分析的多肽覆盖率。
利用此新方法，研究人员比较了EF和其他生物区域的蛋白质含量，结果显示，不论是与肌肉组织还是血清相比，EF中的蛋白质都有很大不同。与整个肌肉组织相比，EF中与细胞外空间相关的蛋白质表达上调；而肌肉组织中与细胞内隔室相关的蛋白质上调。由此可见，不同的EF蛋白质组可能代表了在肌细胞周围的局部隔室中富集的蛋白质。随后分析EF和肌肉组织中分泌的蛋白质数量，结果显示在EF上调的蛋白质中约15.4%为已知的分泌蛋白，而这一数据在肌肉组织中只有4.7%，值得一提的是，那些在EF中没有被注释为分泌型的蛋白仍可能通过非典型途径被分泌。同样的，比较EF和血清中定量的蛋白，EF中有833个蛋白上调，而血清中只有324个蛋白上调，这表明该方法确实能够检测到EF中更多样的蛋白质成分。值得注意的是，与血清蛋白相比，EF中上调的蛋白被注释为分泌型的比例较小，而这可能反映了EF含有通过各种非典型分泌途径（包括细胞外囊泡）分泌的蛋白质。总之，这一新建立的MS方案表明EF方法可以富集分泌蛋白，从而促使新的发现，研究人员表示，这种方法可以用于许多不同的遗传和环境干预背景下的检测。
接下来，研究人员利用此方法检测了三种情况下的EF蛋白质组的变化。
首先，研究人员检测了小鼠肌肉EF蛋白组在单次剧烈运动后的变化。对EF中6507个蛋白质进行量化分析后发现，在运动组和非运动组小鼠的EF中发生显著变化的1322个蛋白质中，有40个已知的分泌蛋白表达上调、35个下调。KEGG通路分析显示，在运动小鼠EF中显著下调的蛋白质中有许多与补体和凝血级联相关的蛋白质。更重要的是，EF谱中还量化了很多以前与运动和/或肌肉组织无关的分泌蛋白。
肌肉特异性PGC1α转基因表达 (MCK-PGC1α小鼠) 已被证明是一种非常有用的遗传模型，它可以模拟运动的某些方面，包括血管生成和更大肌肉神经支配的刺激。对MCK-PGC1α小鼠及同窝对照组的EF进行蛋白质组学分析显示，与对照组相比，MCK-PGC1α小鼠的EF中有824中蛋白质发生了显著变化，其中17种已知的分泌蛋白上调、31种下调，由此表明，肌肉特异性PGC1α表达可重塑EF蛋白质组。
与此同时，研究人员还应用这种EF蛋白质组学方法来探索小鼠产热脂肪中释放的蛋白质。为了描述2种产热脂肪库（棕色脂肪组织BAT和腹股沟白色脂肪组织iWAT）和1中非产热脂肪库（附睾白色脂肪组织eWAT）的寒冷诱导下的EF蛋白质组，研究人员将小鼠置于低温（4℃）下2周后，从BAT、iWAT和eWAT中分离EF，蛋白质组学分析显示，与eWAT相比，iWAT的EF中有1579中蛋白质发生了显著变化，其中172个被注释为分泌型的蛋白表达上调，41个下调。由此表明来自不同脂肪库的EF含有以前未被识别的分泌因子，这些因子在寒冷条件下可在产热iWAT中被诱导，但在非产热eWAT中不被诱导。
有趣的是，研究人员发现，在MCK-PGC1α小鼠的EF中表达上调的前10的蛋白中，有一个高度保守的糖蛋白Prosaposin（PSAP），其已被证明是一种神经营养因子，可以防止神经元降解和轴突丢失，诱导神经再生，在这之前，PSAP从未被鉴定为肌细胞因子或脂肪细胞因子。而在iWAT的EF中发生显著变化的蛋白质中也含有PSAP。进一步地实验结果表明PSAP在肌肉和脂肪中可分别通过PGC1α和寒冷适应被诱导表达和分泌，而且第一次证明PSAP的表达足以促进原代iWAT脂肪细胞的氧化代谢。
综上所述，本研究开发了一种简单快速的EF蛋白组分析方案，并证实该方法可以适用于不同的遗传和环境干预，如运动、组织特异性PGC1α转基因表达和寒冷暴露；它也适用于不同的组织，如肌肉和各种脂肪库。更重要的是，研究表明EF蛋白组的组成和复杂性不同于血清和组织，由此提示EF蛋白质组学方法可能也适用于许多其他组织，包括人类组织，从而可用于开发新的生物标志物，并为治疗干预提供潜在的新靶点。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.12.014
参考文献
1. de Oliveira Dos Santos, A.R., de Oliveira Zanuso, B., Miola, V.F.B., et al. (2021). Adipokines, myokines, and hepatokines: crosstalk and metabolic repercussions. Int. J.Mol. Sci. 22, 2639.
2. Murphy, R.M., Watt, M.J., and Febbraio, M.A. (2020). Metabolic communication during exercise. Nat. Metab. 2, 805–816.
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