撰文 | 望夜

#癌症#

IFN-γ信号途径介导宿主感染、炎症和抗肿瘤免疫反应，通路中基因的突变会导致免疫异常、血液系统恶性肿瘤、及对免疫检查点抑制剂的拮抗作用（ICB）。JAK抑制剂已用于治疗骨髓增殖性疾病，如真性红细胞增多症和炎症性疾病（类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎）【1】，表明JAK-STAT信号通路在上述疾病中的核心作用。肿瘤细胞中的IFN-γ信号途径也是抗肿瘤免疫的关键方面，途径组分（如JAK1和JAK2）的突变或纯合子失活与ICB相关【2】。

肿瘤中的突变多为单核苷酸变化，常导致错义突变（如重要性未知突变（VUS））的出现，目前对该类突变的功能分析仍相对困难。通过实验方法将VUS和疾病相关表型建立起因果联系就显得十分重要。碱基编辑可对内源性基因变异进行大规模前瞻性评估【3】，目前已实现C→T【4】或A→G【5】的转变。

2023年1月19日，英国Sanger研究所的Mathew J. Garnett课题组在Cancer Cell杂志上发表了文章Base editing screens map mutations affecting interferon gamma signaling in cancer，通过CRISPR-Cas9系统和碱基编辑器（BE）产生突变，系统研究结直肠癌细胞中IFN-γ信号途径的遗传决定因素。使用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器对JAK1基因进行深度突变，联合全通路筛选功能缺失（LOF）和功能获取（GOF）的突变，发现血液恶性肿瘤及难治性ICB病人中检测到的突变。使用工程化改造的原代肿瘤类器官对筛选出的VUS进行功能验证，检测对自体肿瘤反应性T细胞敏感性增强或减弱的错义突变，鉴定出超过300个预测可改变IFN-γ信号途径活性的突变，为阐述基因变体功能提供了丰富资源。

作者首先使用CRISPR-Cas9系统分析结直肠癌（CRC）细胞中内源IFN-γ信号的决定因素，发现对IFN-γ信号、JAK-STAT信号机下游转录响应调节最敏感的基因，包括IFNGR1、IFNGR2、JAK1、JAK2、STAT1、IRF1。敲除mTOR、AKT1、WDR24产生显著的IFN-γ抗性，而TSC1、STK11、SOCS1、STUB1为增敏基因。此外还筛选到凋亡相关基因CASP8、BAX、MCL1，及自噬相关基因ATG2A、ATG5、ATF3、ATF16L1。上述基因与此前临床病人中ICB抵抗及癌症免疫逃逸的遗传筛选结果存在相当程度的重叠。

由于敲除JAK1可产生对IFN-γ的稳定抗性，且肿瘤中JAK1错义突变比例高达58.2%，其中52.7%为C→T或G→A转换，作者决定使用CBE进行突变筛选，发现JAK1的VUS。作者选用的是多西环素诱导的碱基编辑器iBE3【4】，以消除脱氨酶组成型表达的潜在毒性。利用靶向JAK1启动子区、非靶向的、靶向基因间区、及向72个必需和28个非必需基因中引入终止密码子的不同gRNA，经过两种筛选策略（长时长增殖筛选和短期基于流式细胞术的筛选），选定24条gRNA用于验证研究，代表15种LOF和5种GOF突变体。此外，还纳入仅在长时长筛选中获得的JAK1 Glu890 gRNA。

为进一步扩展研究错义突变对整个IFN-γ通路的影响，作者纳入更多基因（JAK1、JAK2、IFNGR1、IFNGR2、STAT1、IRF1、B2M、SOCS1）用于CBE突变筛选。两种筛选策略获得的结果显著相关，JAK1 Glu890 gRNA又一次仅出现在长时长筛选结果中；类似情况仅在STAT1中出现，其一组LOF突变仅在长时长筛选中出现富集。编辑JAK1、JAK2、IFNGR1、IFNGR2、IRF1主要产生的是LOF错义突变，而STAT1中出现GOF突变的比例较高。不同突变倾向于集中在特定结构域中，表明碱基编辑可以凸显功能性蛋白结构域。

介于BE3-NGG文库仅可覆盖JAK1上21.4%的氨基酸位点，作者使用Cas9变体改造的BE3.9max-NGN、YE1-BE4max-NGN（降低脱靶编辑并提高编辑精度）及ABE（ABE8e-NGN）扩展可替换氨基酸，再次对JAK1外显子进行编辑，将氨基酸覆盖度提高至39.6%-64.9%，当联合胞嘧啶和腺嘌呤NGN突变时覆盖度达85.1%。合并使用CBE和ABE可对全部20种氨基酸实现至少两种氨基酸的替换。化学性质不同的氨基酸替换可实现更大的平均效果尺寸，特别是Leu→Pro。作者还确认不同CBE的编辑谱和效率存在差异。

为分析筛选出的突变，作者构建临床发现的突变与预测编辑突变体间对应关系的数据库，对不同来源数据进行临床优先级划分。作者发现CBE筛选出的LOG和GOF更可能具有临床优先级，88%的CBE突变发生在肿瘤基因组中具有突变优先级的氨基酸位点，其中32%预测可通过CBE实现氨基酸替换（ABE仅能实现6%）。作者还发现JAK1的假激酶结构域上的GOF突变具有肿瘤临床优先级，特别是Arg724、Val658。LOF位点主要是Gly887、Asp1003、Asp1021、Tyr993、Tyr1034及Lys267，经验证Gly590是一个全新的LOF突变。

至此，作者开始对最初筛选的24条gRNA进行功能验证，包括细胞增殖、信号转导、蛋白表达、RNA表达及流式分析。该分析与前述碱基编辑筛选关系密切，因为共同指向JAK1上的位点（Arg108、Gly590、Asp775、Gly887、Met1099）。多数候选LOF突变的pSTAT1和IRF1水平降低，而Met1099和Arg1103 GOF可产生更高水平的JAK1蛋白和JAK-STAT信号，Gly590 LOF突变体也产生更高水平的JAK1蛋白，尽管其对IFN-γ的敏感性降低。JAK1 706/707 gRNA靶向一个剪接区域，会严重降低JAK1蛋白表达，水平类似临床上的Trp690的无义突变；Glu1123的剪接变体也可将JAK1的RNA水平将至Trp690*水平。但基础JAK1变体的RNA表达水平只有轻微影响，且RNA表达并不能完全指征JAK1蛋白水平。随后作者又制备40株IFN-γ通路上其他基因突变体的敲入细胞株或肿瘤类器官，通过流式细胞术分析IFN-γ刺激后MHC-I和PD-L1的表达水平。除负调节因子SOCS1外，LOF突变对IFN-γ的响应均降低。STAT1的功能变体在IFN-γ刺激后表现出显著的增殖优势，尽管其MHC-I和PD-L1表达几乎不受影响；而Asp257 STAT1 GOF突变对IFN-γ的敏感性显著增加。

为明确分配碱基编辑基因型，作者对内源性JAK1位点进行扩增子测序，确认碱基编辑预测的准确性，即C→T编辑集中在BE3的活性窗口处（距离PAM约4-9位），另有22.7%的gRNA会在上下游出现低频编辑，导致在原间隔区（protospace）的2、3和11位出现两个意料之外的编辑突变。进一步使用单细胞测序（scDNA-seq）进行基因型分配，发现对于JAK1的87条gRNA，scDNA-seq与扩增子测序在基因型间显示出很强的一致性。对检出JAK1编辑的gRNA，预测与观察到的蛋白变化均存在重合，其中81%的预测包含了全部检出的氨基酸变化。scDNA-seq的一大优势是可检测编辑外显率（即纯合子）。根据临床数据，作者预测对JAK1等位基因的纯合编辑是LOF表型所必需的，这也是检测到最频繁（59%）的编辑结果。在纯合子编辑中，83%集中在编辑窗口的4-9位，而纯合杂合混合编辑中该比例为76%。此外，作者还分析了未能检出JAK1编辑的37条gRNA的原因。

作者进一步挖掘癌细胞模型中外显子组测序数据以明确前述JAK1 LOF和GOF突变的功能。JAK1 Val658Phe GOF、推测的Glu1051Gln和Ala760Val JAK1 LOF错义突变曾在之前的测序中检出。最后，作者将发现的重要编辑突变在CRC-9原代肿瘤类器官中进行验证，其来源于一位MSI结直肠癌病人，并在其PBMC中分离出自体肿瘤反应性T细胞。确认可在类器官中重现BE3-NGG碱基编辑筛选后，作者在类器官中验证检出的JAK1错义突变，发现JAK1上108、590和775位的LOF错义突变可显示对IFN-γ的抗性。当共培养肿瘤活化T细胞与编辑后的类器官时，所有测试的JAK1 LOF突变类器官均显示出显著的T细胞抗性，某些甚至达到抗体阻断后的存活率。相反，GOF突变Met1099Ile对T细胞敏感性增加。因此，作者认为通过碱基编辑定位的IFN-γ突变图谱可能对抗肿瘤免疫具有指示作用。

回顾全文，作者利用功能基因组系统分析结直肠癌中影响γ干扰素（IFN-γ）反应的遗传因素。通过系统性的碱基编辑对结直肠癌细胞的IFN-γ通路进行突变，分析确认肿瘤和免疫异常相关突变体。作者发现突变发生可反映功能蛋白结构域和互作界面，JAK1上的错义突变会改变肿瘤类器官对T细胞的敏感性。这种通过碱基编辑对关键信号组分进行突变、批量完成基因变体功能分析的方法，有助于理解IFN-γ信号途径在癌症免疫监视和免疫异常中的作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.12.009

参考文献

1. Schwartz, D.M., et al. (2017). JAK inhibition as a therapeutic strategy for immune and inflammatory diseases. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 843–862.

2. Shin, D.S., et al. (2017). Primary resistance to PD-1 blockade mediated by JAK1/2 mutations. Cancer Discov.7, 188–201.

3. Després, P.C., et al. (2020). Perturbing proteomes at single residue resolution using base editing. Nat. Commun. 11, 1871.

4. Komor, A.C., et al. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature533, 420–424.

5. Gaudelli, N.M., et al. (2017). Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature551, 464–471.

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