益生菌（probiotics）通过改善宿主微生态平衡而发挥益生作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。存在于动物和人体内的有益微生物主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等，其中，丁酸梭菌作为益生菌的一种，在畜禽饲料中添加饲用丁酸梭菌制剂，对于减少当前饲料中抗生素产品的滥用、减少药物在肉品中的残留、降低动物细菌的耐药性和保障动物健康有着重要的意义。因丁酸梭菌具有耐热、耐酸及耐受多种抗生素等的特点，是一种较理想的具有广泛开发前景的益生菌制剂。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢菌，呈直杆状或稍有弯曲，广泛存在于人和动物体的肠道中，能有效抑制肠道致病菌的繁殖，调整肠道微生态平衡，同时减少氨类、胺类等有害物质的产生。丁酸梭菌制剂中活菌是以芽孢形式存在，对各种恶劣环境、存贮及加工运输过程中的高温、高湿、酸性、机械摩擦和挤压等因素具有很强的稳定性。因此添加在畜禽饲料中能够抵抗饲料加工过程中的高温、高热及其胃肠道酸性环境，具有很强的市场竞争力。

目前对丁酸梭菌的作用机制、培养条件和在畜禽生产中的应用研究的已非常广泛，但几乎都采用液体培养的方法。与液态培养相比，固态培养具有成本低、操作简便等优点。同时液态培养时生长量总是不能满足生产需要，且畜禽肠道菌所生存的环境本身为固态或半固态环境，因此本试验选用价格较为低廉的农副产品豆粕、麸皮等为原料，对丁酸梭菌进行固态培养研究。

一、材料与方法

1 菌种与培养基

菌种：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）为山东宝来利来生物菌种保藏中心保存。

丁酸梭菌液体种子培养基：各物质按质量分数计为葡萄糖2%、牛肉膏1.5%、蛋白胨2%、碳酸钙1%、七水硫酸镁0.02%、一水硫酸锰0.02%。调整pH为7.0，37 ℃静止培养24小时，芽孢率95%以上。固体培养基加琼脂粉1.5%。

固态基质豆粕、麸皮，料水比为1:1.2，各生长限制因素按试验设计溶解在水里添加到固体培养中，提前调整水的pH为7.0。

2 方法

2.1 丁酸梭菌的固体发酵培养

从丁酸梭菌斜面中挑取一环接种于种子培养液中，静置培养24小时后镜检芽孢率95% 以上，接种到含固体培养基的三角瓶中培养，培养温度37℃。按体积分数5%接种到固体发酵培养基中，静置培养。以上操作均在无菌操作条件下进行。

2.2 活菌数测定

固体发酵培养基中活菌数测定：取发酵好的固体培养基5 g，加入装有100 mL含玻璃珠的无菌水的三角瓶中，280 r/min振荡30min摇匀，取1 ml梯度稀释，倒平板，丁酸梭菌固体种子培养基进行计数（以每克样品中的菌落数进行计数CFU/g表示）。

二、试验设计

1 不同固态基质下丁酸梭菌的生长情况

我们选用了豆粕、麸皮和玉米面3种固态基质作为培养基，葡萄糖和氯化钙均以0.5%和0.2%添加，121 ℃，30分钟灭菌，5%接种量接种，37 ℃恒温培养72小时，取样镜检，芽孢率75%以上，分别取5 g湿料进行活菌计数.

我们进行了几次重复试验，结果类似，3种固态基质中均以豆粕最佳，72小时后活菌数最高可达3.9×107 CFU/g，平均在3.6×107 CFU/g；麸皮次之，活菌数最高可达3.0×107 CFU/g，平均为2.8×107 CFU/g；玉米面最差，平均为1.9×107 CFU/g，其原因可能是豆粕中含有丰富的可供丁酸梭菌利用的营养物质。虽然以豆粕为固态基质时活菌数最高，但也远远不能达到生产需要，固在此基础上进行了改进。

2 正交设计

为了找到一种能够提高丁酸梭菌活菌数的固态培养配方,我们进行了几次重复试验，结果类似。其中4组合活菌数最高，可达2.2×108CFU/g；其次为6组合，最高为1.6×108CFU/g；其余各组合均低于1.0×108 CFU/g。

直观分析法分析三因素影响程度为：豆粕：麸皮>葡萄糖>氯化钙，4配方活菌数最高，即豆粕：麸皮为1:1，氯化钙为0.2%，不添加葡萄糖。

3 讨论一下

作为一种微生态制剂的重要菌种来源的丁酸梭菌的培养几乎都是液态培养，鉴于液态培养成本高，操作困难，活菌数低等特点，本试验摸索了丁酸梭菌固态培养的条件。通过试验得出最佳培养基为，豆粕：麸皮为1:1，氯化钙0.2%；发酵条件为：时间72小时、温度37℃、接种量5%。在此条件下丁酸梭菌活菌数可达2.2×108CFU/g。这为丁酸梭菌的固态发酵培养提供有益参考。

作者：谢全喜