什么是基因组survey？

基因组survey：即基因组大小和复杂程度的调研，基因组大小是指单倍体细胞核中的所含的DNA的总量。常用的估计基因组大小的方法有两种：

其一是流式细胞法，该方法用DNA含量衡量不同物种基因组的大小，基因组的大小通常用“C-value”来表示，也有用“pg”（皮克）单位来表示，1pg=10-12g，另外也有用“碱基对”来表示，例如1Mb=106bases，之间的直接换算关系是1pg=978Mb或者1Mb=1.022×10-3 pg，流式细胞法是通过DNA荧光染料对分选后的细胞进行染色，然后和已知DNA含量的商品化标准品比对，得到检测物种的DNA含量，进而通过上面的换算关系推测出基因组大小。

其二是高通量测序法，即对没有参考基因组序列的物种，进行小片段低深度测序，以较低的成本基于K-mer分析去预估基因组的大小、杂合度及重复序列等信息。该结果可进一步指导后续的建库策略和测序数据量，此外这次测序的数据还可用于后续基因组的拼接与拼接结果的校正。今天小编重点向大家介绍基于高通量测序的方法估计基因组大小、杂合度及重复序列。

基于K-mer评估基因组大小的原理

假设reads的长度为L，基因组大小为G，总的reads数目N，kmer长度为K，即将长度L的reads打断成K长度kmer片段且kmer每次延伸1bp，则该条read会被打断为L-K+1个kmer，例如：当K=17，reads长度L=100的时候，一共可以产生100-17+1个kmer片段。

根据Lander-Waterman模型，Kdepth=N*(L-K+1)/G，Knum=(L-K+1)*N(Kdepth为kmer的期望深度，kmer深度频率分布遵循泊松分布，可以将深度分布曲线的峰值作为期望深度。Knum为从reads得到kmer的总数目），则基因组大小G=Knum/Kdepth，K的选择和测序深度会对基因组估计大小产生影响，短片段插入库数据深度不用过低或过高。

基因组大小估计结果解读

了解完原理接下来我们就利用基因组survey比较经典的一款软件Jellyfish来统计K-mer depth及频数，统计结果用于画K-mer分布图及基因组特征的评估。K-mer 深度分布曲线属于标准的泊松分布曲线，该曲线的形态受到以下几个因素的影响：测序错误率、基因组的杂合度和重复序列。以一个杂合度较高的物种的 K-mer 分布图为示例图图1：

图1Kmer分布示意图

注：最左边的峰为测序错误峰；第二个峰为杂合峰，如果基因组杂合度比较低，则不会出现该峰；第三个峰为纯合峰，杂合峰的峰值所在位置一般为纯合峰所在位置的一半，基因组的杂合度越高，则杂合峰与纯合峰的比值越大；第四个峰为重复序列峰，在纯合峰值所在位置的两倍以上，重复序列越高，重复峰所占面积越大。

测序错误峰：当某个碱基发生测序错误后，将其reads打断成长度K的kmer后，会将错误的kmer数量放大，这些kmer出现频率较低，在Depth较低时会出现较高的错误峰，用于评估测序错误率。

纯合峰：c值即为公式中的Kdepth用于评估基因组大小。

杂合峰：用于评估基因组杂合度。具体解释为：假设纯合的GTA在Kmer中出现了a次即深度a，而杂合GTA中T为T/A，则就会形成GTA/GAA两种kmer，则每种对应就会平均出现a/2次即深度为a/2。

Repeatregion：用于评估基因组重复序列比例，若出现两个主峰，峰高相差不大且横坐标是2倍关系，则为高杂合或高重复。

以某动物为例，PE400文库Hiseq平台测105G数据量，使用软件Jellyfish设置K=17，得到95,767,623,756个kmer，纯合峰对应的Kmer深度为118，最终估计出基因组大小约为812M，Kmer分布图见下图2。

图2某动物Kmer分布示意图

动植物基因组推出的基因组survey项目，分析内容包括：

l 原始数据质控；

l 样本质量分析：物种污染评估；

l 基因组评估：基因组大小、杂合度、重复序列比例评估等。测序数据也可以在后续做基因组拼接和校正时再次利用哦。