植物免疫是生物学领域的研究热点之一。国内外研究者以拟南芥、烟草等模式植物为材料，在NLR免疫受体的结构、功能和信号传导等方向获得了一系列成果，最近几年更是取得了多项重大突破。这些成果给作物NLR抗病蛋白的功能和机理研究带来了很大的启发。来自野生物种簇毛麦的Pm21对小麦白粉菌具有广谱抗性，它也编码NLR蛋白，揭示其抗病分子基础具有重要意义。自2018年图位克隆Pm21以来，我们对含Pm21的易位系品种扬麦18进行较大规模的EMS诱变，前后积累了113个感白粉病突变体，进而测定Pm21基因的序列，揭示了导致抗白粉病功能丧失的关键位点及突变规律。
1、获得了113个Pm21感白粉病突变体
经EMS处理扬麦18种子后，利用毒性菌BgtYZ01从4000多个M2家系中初步筛选到116个候选感白粉病突变体(图1)。为了排除非靶标变异，我们将所有候选突变株系与先前获得的突变株系Y18-S7(该株系的Pm21存在提前终止，编码蛋白仅280个氨基酸(aa)，完全丧失了抗性)杂交，并鉴定F1表型，其中3个候选突变体的F1表现为抗病，而113个候选突变体的F1仍为感病，无功能互补效应，从而确定这113个株系为Pm21突变体(图1)。在这些突变体中，Y18-S6存在染色体片段水平的变异，丢失了整个Pm21位点，其余112个突变体都涉及Pm21自身序列的点突变，其中112个突变体都只含1个碱基变异，5个突变体各含2个碱基变异(由于不能确定具体是哪个位点变异导致功能丧失，这5个突变体未进行后续分析)。
图1 扬麦18感白粉病突变体
通常，EMS诱变存在特定的变异倾向。在本研究统计的107个突变位点中，59个为G>A变异(占55.2%)，47个为C>T变异(占43.9%)，1个为A>T变异(0.9%)。在107个突变位点中，25个导致出现提前的终止密码子，编码截短蛋白(178-843 aa)，最大的截短蛋白为843 aa，它保留了13个LRR基序，可见PM21(共有16个LRR基序)的第14-16个LRR基序对白粉病抗性极为重要。其余82个突变位点都引起了单个氨基酸变异。排除重复性变异位点后，我们进而分析了59个独特变异。
2、PM21功能缺失变异具有较强的倾向性
前人对拟南芥、烟草等NLR蛋白进行研究时，揭示了一系列较为保守的基序(motif)，PM21为典型CC、NB-ARC、LRR结构域的NLR蛋白，也具有这些保守基序。我们提出以MPHA(mutations per one hundred amino acids)为指数统计59个氨基酸变异在不同结构域/非结构域、保守基序/非基序中的分布规律。结果显示，CC和NB-ARC结构域的MPHA指数分别为10.1和7.2，显著高于全长蛋白(6.5)，LRR结构域的MPHA更低，仅为4.4。Linker 1(CC、NB-ARC结构域的衔接区)的MPHA值为11.1，与CC结构域相近，而Linker 2(NB-ARC、LRR结构域的衔接区)的MPHA值为4.5，与LRR结构域接近。可见这两个衔接区对维持PM21的功能也较为重要。
CC结构域nT基序的MPHA指数极高，为21.1，非基序区也达到了8.6。在NB-ARC结构域中，基序区的MPHA高达19.6，极显著高于非基序区(仅为2.5)。在各基序中，Kinase-1a和GLPL基序的MPHA值分别高达50.0和57.1，与它们对NLR保守功能的关键作用高度相关。在RNBS-A、Kinase-3a、WIAEGF和MHD中，我们没有发现变异。在LRR结构域中，LRR2、LRR3、LRR4、LRR6、LRR12和LRR14的MPHA值高于LRR区平均值(4.4)，LRR5、LRR10和LRR11的MPHA低于LRR区平均值，而在其余LRR基序中都没有发现变异(图2、图3)。上述结果表明，PM21功能缺失变异具有较强的位点倾向性，暗示了这些位点对维持抗性的重要性。
图2 59个氨基酸变异位点的分布与频率
图3 LRR结构域中变异位点的分布
3 、发现一个新的NLR蛋白突变热点
LPLHLRP(第414-420位)位于NB-ARC结构域的RNBS-D基序之前，我们发现7个突变体所涉及的5个氨基酸变异都位于该区段，包括：L414F(Y18-S12)、P415L(Y18-S59)、L418F(Y18-S112)、R419H(Y18-S58)和P420S(Y18-S19、Y18-S79、Y18-S82)，MPHA指数高达71.4，显著高于已报道的保守基序。我们将目前已克隆的26个小麦和大麦NLR进行比对分析，数据显示它们在LPLHLRP区段较为保守，核心序列为：LPx(H/N/Y/D)(L/M/I)(K/R/Q)(T/Q/P)(图4)。该结果表明，新的突变热点LPLHLRP在NLR蛋白中具有重要功能，值得深入研究。
图4 突变热点LPLHLRP在麦类NLR蛋白中具有保守性
4 、CC结构域的E44K变异能导致显性负效应
为了挖掘对Pm21抗性产生显性负效应的突变体，我们将所有突变体与野生型扬麦18 进行杂交并分析F1的表型，发现100个组合的F1都抗白粉病，3 个杂交组合(扬麦18/Y18-S13、扬麦18/Y18-S23、扬麦18/Y18-S100)的F1都感病(图5 )，且F2出现表型分离，抗病:感病比例符合1:3。因为Pm21是一个显性抗病基因，所以Y18-S13、Y18-S23和Y18-S100中的变异对Pm21产生了显性负效应(dominant negative effect)。这三个突变体是从不同的M2家系独立获得，其Pm21在CC结构域的编码区具有相同的变异(G130A)，导致氨基酸变异E44K，由此可见，该位点的变异引起了显性负效应。
图5 显性负效应的表型鉴定
5、总结
本研究利用EMS诱变、遗传分析等手段，鉴定了NLR蛋白PM21的59个功能位点，揭示了其分布规律，发现了一个突变热点和一个显性负效应位点，为深入研究PM21的结构和功能打下了基础。就统计方法而言，本文提出的MPHA指数，可以较好地反映NLR蛋白的结构域和基序的重要性。不过，有些保守基序未出现变异并不意味着它们对功能不重要，而可能是因为目前的突变还远没有饱和，尚不能覆盖全蛋白。
2022年8月9日，上述研究成果发表在植物学主流期刊《Frontiers in Plant Science》上，题目为“Large-scale mutational analysis of wheat powdery mildew resistance gene Pm21”。江苏大学何华纲副教授为第一作者/通讯作者，朱姗颖副教授为共同通讯作者，历届研究生参与了突变体的筛选和鉴定，河南大学高安礼副教授也参与了本研究。该研究得到国家自然科学基金、镇江市重点研发计划等项目的资助。
主要参考文献：
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