简介

饲养层技术取决于通过其他接触抑制细胞形成的单层预防成纤维细胞的过度生长。饲养层技术并不能选择性抑制正常上皮细胞，W为正常表皮细胞和正常乳腺上皮都能在汇合的伺养层上形成克隆。然而，神经胶质瘤研究的结果表明，在同种饲养层上选择培养等同的正常细胞是可能的。

原理

在指数生长中期，用丝裂霉素C处理饲养层细胞，将细胞培养形成汇合的单层。通过胶原蛋白酶消化从活检标本分离肿瘤细胞，或者用胰蛋白酶消化从原代培养物获得肿瘤细胞，然后将肿瘤细胞接种到汇合的单层上（图24.1）。上皮性肿瘤细胞可以在3周至3个月内形成克隆。纤维肉瘤和神经胶质瘤并不总是形成克隆，而可侵入饲养层，并逐渐过渡生长。

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操作方法

材料与仪器

3T3细胞STO细胞10T1 2细胞 生长培养液胶原蛋白酶胰蛋白酶 手术刀Petri培养皿

步骤

一、材料 无菌 1.饲养层细胞（如3T3、STO、10T1/2或FHS74Int） 2.1 mg/ml丝裂霉素C（Sigma） 注意：

首次使用饲养层细胞时，最好作丝裂霉素C的剂量反应曲线，证实这个剂量能使饲养层细胞存活2~3周，但使细胞最多进行两个倍增后不再继续增殖。在这种情况下，按如下步骤进行： （1）将25 cm2培养瓶中的细胞用1~100μg/ml丝裂霉素C处理过夜（18 h）； （2）用胰蛋白酶消化细胞后，以20 ml新鲜培养液将培养瓶中的全部细胞再接种到75 cm2培养瓶中； （3）将细胞培养3周，每周换液2次； （4）将细胞染色，检查存活的克隆。 2.生长培养液 3.2000 U/ml胶原蛋白酶，CLS级（Worthington）或相当级别 4.0.25%胰蛋白酶，用PBSA配制 5.肿瘤活检标本或原代培养物 6.装有22号刀片的手术刀 7.Petri培养皿，用于解剖，同原代培养中的Petri培养皿 二、操作步骤 1.在6个75 cm2培养瓶中，将饲养层细胞培养至80%汇合。 2.加入丝裂霉素C至合适的终浓度，一般约为5μg/ml。 3.用丝裂霉素C孵育细胞过夜（约18 h）。 4.移出含丝裂霉素C的培养液，用新鲜培养液浸洗细胞单层。 5.将细胞进一步培养24~48 h。 6.用胰蛋白酶消化细胞，以5X105个/ml（1X105个/cm2）的密度将细胞再接种到25 cm2培养瓶中。将细胞培养24 h。 7.如果使用活检标本，需将标本切开，第2步放入胶原酶中。​ 8.将从标本获得的细胞悬液以20~100 mg/瓶接种到两个25 cm2培养瓶中，每瓶含6 ml细胞悬液。从每个培养瓶中取出1 ml悬液，分别放入另外两个培养瓶中，加培养液至4 ml。第3对培养瓶作为对照，检查丝裂霉素C处理后饲养层细胞的存活能力。