今日推送的文章是发表在Acta Crystallographica Section D Structural Biology的“Kinetic and structural studies of the reaction of Escherichia coli dihydrodipicolinate synthase with (S)-2-bromopropionate”，作者为中央俄克拉何马大学化学系的Lilian Chooback。
由于l-赖氨酸生物合成途径存在于细菌中而不是哺乳动物中，因此开发新型抗菌药物中抑制细菌的l-赖氨酸生物合成途径成为重要关注领域。
真菌和拟南芥利用氨基己二酸(AAA)途径合成l-赖氨酸，二氨基庚二酸(DAP)途径存在于所有具有双鞭毛孢子的细菌、蓝绿藻、维管植物和藻菌真菌中。二氢二吡啶甲酸合成酶(DHDPS)通过DAP途径催化赖氨酸生物合成的第一个限速步骤，涉及天门冬氨酸的缩合反应，如图1所示。半醛(ASA)和丙酮酸形成二氢吡啶甲酸二氢吡啶酯(DHDP)，其中干扰DAP途径可有效导致细胞裂解。抗生素的主要作用的机制是酮吡酯和约35个酮吡酯类似物对结核分枝杆菌DHDPS对DAP生物合成途径有抑制作用。
文章通过以下两个公式拟合数据。式(1)中，v为初始速率，V为最大速率，A为底物浓度，I为抑制剂浓度，Km为Michaelis常数，Kis为抑制常数。式(2)中，Vt为时刻t的速率，V0为时刻0的速率，k为衰减常数。
文章中已经确定大肠杆菌DHDPS的三维结构，以及大肠杆菌DHDPS的五个点突变体的结构，来自大肠杆菌的DHDPS酶是一种摩尔质量约为140000 Da的四聚体。作者分别编码DHDPS和二氢二吡啶甲酸还原酶(DHDPR)的大肠杆菌dapA和dapB基因并纯化得到his标记的酶。
图2显示了(S)-2-溴本体酸对丙酮酸的抑制模式。(S)-2-溴本体酸对丙酮酸的抑制模式。(S)-2溴本体酸浓度分别为0 mM(正方形)、6 mM(圆形)和12 mM(三角形)。丙酮酸在0.03到0.25 mM之间变化。
通过文章数据可观察到(S)-2-溴本体酸与酶结合的亲和力不高，这表明其解离常数几乎比丙酮酸的Km大40倍。虽然(S)-2-溴本体酸与丙酮酸在结构上有一些相似之处，但差异是显著的。最重要的区别可能是丙酮酸和(S)-2-溴本体酸在C2的几何位置不同。(S)-2-溴本体酸的C2处的四面体构型很可能不允许在有利于丙酮酸结合的活性位点内进行通常的相互作用。而且(S)-2-溴本体酸含有良好的离去基，使分子容易在C2处受到亲核攻击。
该抑制剂的这一特性表明，Lys161攻击(S)-2-溴本体酸的C2可能导致该酶在Lys161位点的共价修饰，从而使该酶失活。通过与(S)-2-溴本体酸预孵育酶，并检查随着时间的推移残留酶活性，来研究这种可能性。
实验结果如图3所示。图中显示，DHDPS活性随时间的推移而丧失，这取决于(S)-2-溴本体酸的浓度。在2,4和8mm (S)-2-溴本体酸下失活的速率常数为0.026±0.001, 0.051±0.002和0.095±0.003每分钟，根据公式(2)拟合不同浓度(S)-2-溴本体酸的数据。图3还显示了酶与8mm (S)-2-溴本体酸和2mm丙酮酸预孵化酶的实验。
沉积在PDB中的大肠杆菌DHDPS结构显示了两个四聚体，共包含8个单体(标记为a - d和E-H)，每个单体包含一个活性位点。在八个单体中的七个中，有一个甘油分子结合在从赖氨酸变构位点向活性位点延伸的空腔中。每个活性位点都有(S)-2-溴丙酸修饰的Lys161，形成共价的赖氨酸丙酸加合物。加合物的位置及其与活性位点群的相互作用从一个活性位点到另一个活性位点都是相似的。活性位点上丙酸的位置变化最大的是丙酸的一个羧基O原子到Tyr133羟基之间的距离。这一距离从2.6到3.8 Å不等。用所有单体计算的平均距离为3.43Å。活性位点基团和丙酸之间的距离有一些微小的代偿性变化，这些变化与Tyr133到羧基的距离不同有关。对于图4所示的酶-丙酸结构，我们使用亚基B作为代表，因为该亚基中Tyr133到羧基的距离为3.5 Å，这与所有亚基的平均距离接近。(S)-2-溴本体酸作用下酶的x射线晶体结构证实了(S)-2-溴本体酸对DHDPS的共价改性。
图4显示了活性位点与(S)-2-溴本体酸形成的结合加合物的结构(图4a)，作为比较，酶与天然底物丙酮酸反应形成的结合加合物的活性位点(图4b)。该图还显示了结合加合物与活性位点基团之间的距离，它们非常接近(在3.5 Å范围内)。Lys161的“氨基”与丙酮酸相互作用，通过攻击丙酮酸的羰基C原子，损失水分并生成席夫碱中间体。羧基与Thr45的羟基侧链以及Thr45和Thr44的主链N原子形成氢键作用。这些相互作用将羧基与甲基和涉及到Lys161的N原子的亚胺键置于本质上相同的平面上。
图4 (a)在酶的活性部位DHDPS与丙酮酸反应形成的共价加合物。(b)与(S)-2-溴本体酸反应形成的共价加合酶的活性位点(PDB入口6nva)。每个结构的氢键相互作用都显示出来了。(S)-2-溴本体酸作用下酶的x射线晶体结构证实了(S)-2-溴本体酸对DHDPS的共价改性。
与丙酮酸相比，共价键结合的丙酸在反应形成过程中有许多不同之处。Lys161的“-氨基与(S)-2-溴本体酸的C2反应会导致Br¯与丙酮酸形成的亚胺键相反，丙酸和Lys161之间生成单键。结合的丙酸酯的C2是手性的，呈r构型。由于修饰酶的2-溴丙酸是s构型，这表明在sn2型反应中，Lys161的“-胺”发生了背面攻击，导致构型逆转。在与丙酮酸形成的结构中，羧基的一个O原子与Thr44 (3.4 Å)和Thr45 (2.9 Å)的主链N原子以及Thr45 (2.8 Å)的羟基侧链相互作用。在(S)-2-溴本体酸结构中，一个羧基O原子以类似的方式与Thr44和Thr45相互作用。丙酮酸结构中羧基的第二个O原子距离Thr44的主链N原子2.8 Å ，距离Thr44侧链羟基3.5 Å。相比之下，(S)-2-溴本体酸结构中的第二个羧基O原子与Thr44的主链N原子相接3.3 Å，与Thr44的羟基相接3.5 Å以上。此外，该O原子距离Tyr133的羟基为3.5 Å。在丙酮酸结构和(S)-2-溴本体酸结构中，Tyr133距离Lys161的N原子都在3.4 Å范围内。总的来说，丙酮酸和(S)-2-溴本体酸结构中活性位点基团和共价加合物之间的相互作用是非常相似的。
(S)-2溴本体酸形成的加合物羧基在DHDPS活性位点与丙酮酸羧基位置相似，这表明(S)-2-溴本体酸的羧基参与了(S)-2-溴本体酸的结合和定向，有助于将其置于Lys161攻击的位置。丙酮酸和(S)-2溴本体酸形成的结构之间的差异可以在图5所示的两种结构的叠加中最好地观察到。两种结构的甲基位于相似的位置，但共价结合的丙酸酯的羧基比丙酮酸酯的结构略向T yr133方向偏移。两种结构中最显著的差异涉及Lys161。在由(S)-2-溴本体酸形成的结构中，Lys161的脂肪链发生了显著的扭转，这一运动取代了Lys161的N原子的位置，并允许结合的丙酸的其余部分与共价键结合的丙酮酸结构相当紧密地覆盖。该抑制剂(S)-2-溴本体酸与DHDPS结合的亲和力较低，因此不太可能作为抑制剂开发的先导化合物。
结果表明，在高亲和力抑制剂的适当位置具有良好的离去基的化合物，可能导致酶的失活。具有适当反应基团的紧密结合抑制剂可作为一种可能的药物候选。
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DOI： 10.1107/S2059798322005125
文章链接：https://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S2059798322005125
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