蛋白质工程 protein engineering

胰岛素分子模型

一种以基因工程为基础，通过改造编码蛋白质的基因结构，取得比天然蛋白质更适合人类需要的蛋白质的生物技术。

1978年美国科学家赫金森采用J.莱德伯格于1960年提出的用寡聚脱氧核糖核苷酸指导DNA体外突变的方法成功地实现了定点突变实验，并获得了多种具有不同生物学特性的突变体。

1983年美国的K.厄尔默首次将这种定点突变技术取得具有不同生物学特性的蛋白质的技术称为蛋白质工程。由于蛋白质工程的基础是基因工程技术，但是，通过蛋白质工程可以取得比天然蛋白质更适合人类需要的蛋白质，因此，人们又称其为第二代的基因工程。

蛋白质工程按其对蛋白质进行结构改造方案的设计可以分为合理设计的蛋白质工程和非合理设计的蛋白质工程。

核糖核酸酶

前者是根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，按照人类自身的需要，定向设计改造天然的蛋白质，最后创造出新的自然界本不存在的具有优良特性的蛋白质分子。

后者则不需要事先了解蛋白质的精细结构，也不需要了解该蛋白质发挥生物学功能的确切机制，而是按照蛋白质自然进化的方式，通过各种突变技术在体外改造编码蛋白质的基因，然后，采用基因工程的手段表达出突变的蛋白质，再按照需要选择出具有优良特性的蛋白质。由于非合理设计的蛋白质工程，采用了模拟蛋白质的天然进化过程，所以也有人将这

种蛋白质工程称为进化蛋白质工程。

合理设计的蛋白质工程可以分为以下几步：

①测定蛋白质分子的空间结构，或根据结构预测得到近似的结构模型。

②探讨蛋白质生物学功能与其空间结构之间的关系，在结构上找到与感兴趣的功能有关的位点。

③选择合适的改造方案。

④利用计算机对上述的改造方案进行模拟和优化。

⑤通过基因工程技术得到改造后的蛋白质。

⑥对产物的结构和生物学活性进行定，分析成败原因，为下一轮的设计提出优化意见。

由于蛋白质结构的复杂性以及人们对蛋白质结构和功能关系认识的局限性，通常要经过多次不断的探索才能取得较好的结果。

利用合理设计的蛋白质工程已取得了可喜的成果：

天然的核糖核酸酶热稳定性差，改变结构在其内部引入二硫键，已经取得了热稳定性好的核糖核酸酶。

胰岛素分子间由于弱的相互作用在溶液中会形成无活性的聚合体，改造与胰岛素分子间相互作用有关的表面残基，减弱这种相互作用，研制成了一种速效型的胰岛素。

组织型纤维蛋白酶原激活因子（tPA）是一种用于溶血栓的蛋白类药物。这种天然的蛋白质由于和纤维蛋白的亲和力不高，因此溶解血栓的专一性较差，容易引发出血。另外，由于tPA会被另一种称为PAI-1的蛋白质所抑制，并能与肝受体结合，使其在体内的半衰期很短。因此，tPA在临床使用时用药量大，副作用也大。

通过蛋白质结构和功能的分析确定tPA第296位到第299位的4个氨基酸是抑制剂PAI-1的结合位点。将此4个氨基酸都换成丙氨酸，得到一种称为TNK-tPA的产品。后者在血浆中的清除速度要比tPA慢4倍，与纤维蛋白的选择性可增强14倍。临床上不仅可以减少用药剂量，而且可以降低再梗塞的发生率和减轻出血等不良反应，充分显示了蛋白质工程的威力。

但是，由于人们对蛋白质的结构和功能的关系的认识还很初步，因此开展合理设计的蛋白质工程的效率还比较低。此外，研究工作的花费又相当的大，因此，应用的范围比较小。

非合理设计的蛋白质工程可以分为以下几步：

①克隆编码拟改造蛋白质的基因。

②通过不同方法在基因内随机引入突变。

③采用基因工程技术表达突变蛋白质。

④通过不同的方法筛选出具有预想特性的蛋白质。

其中关键的步骤是引入随机突变和筛选两步。引入随枧突变的方法有多种，其中包括：易错PCR法、DNA改组法、体外随机引发重组法、交错延伸法以及体外随机定位诱变法等。在随机引入突变的过程中、尽管突变具有随机性，但是为了缩小突变库的容量，减少工作量必须控制实验条件，限定突变种类，采用较低的突变率。

筛选的方法也有很多种，但是筛选的方法必须灵敏、简便，而且应该与预想得到的蛋白质性质密切相关。选择合适的随机突变方法及筛选方法是非合理蛋白质工程技术的核心。

非合理设计的蛋白质工程突出的优点是：不需事先知道蛋白质的空间结构，它适宜于任何蛋白质分子，大大拓宽了蛋白质工程的研究和应用范围。

此外，非合理设计的蛋白质工程技术简便、快速、耗资低且易见实效。利用这项技术已经使多种酶改变了稳定性、底物专一性或催化活性，提高了手性化合物中间体的生物催化效率，在抗体噬菌体库的构建和进化及在大肠杆菌甲硫氨酸阻遏物DNA结合位点的进化上发挥了作用。

但是要使这一技术得到更大的发展还需要进一步探索发挥定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力，同时对选择方法尚待进一步开发和完善，要发展大规模自动化的筛选方法，要建立对一些无明显可借鉴表型的突变体的筛选方法。

在开展非合理设计的蛋白质工程的过程中，可以取得大量有关蛋白质的结构与功能关系的知识，这些知识的积累将为合理设计的蛋白质工程打下扎实的基础，合理设计的蛋白质工程最终将成为人类改造蛋白质的主要工具。

摘自：《中国大百科全书（第2版）》第4册，中国大百科全书出版社，2009年