来源：小桔灯网

作者：动力彩虹

2019年冠状病毒病（新冠肺炎）由SARS-CoV-2引起，于2020年3月11日被世界卫生组织（WHO）宣布为大流行。迫切需要敏感和特异的检测方法，以检测病毒感染以及随后在个人和人群水平上的免疫反应，这为加快新技术的开发和验证提供了巨大机会临床应用的诊断技术。基于CRISPR的测试方法是在资源有限的情况下通过检测病毒RNA诊断新冠肺炎感染的最有吸引力的工具之一。目前，美国食品和药物管理局（FDA）已通过紧急使用授权（EUA）批准基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK和Cas12介导的DETECR用于商业用途。尽管作为核酸测试（NAT）取得了显著成功，CRISPR-Cas系统尚未被用于敏感检测抗SARS-CoV-2抗体，这是诊断、监测大流行进展以及评估受感染个体和接种者的保护性体液免疫的另一类重要生物标志物。

迄今为止，许多免疫测定法，如酶联免疫吸附测定法（ELISA）和化学发光免疫测定法（CLIA），已经开发并商业化用于检测抗SARS-CoV-2抗体，但由于繁琐的洗涤和操作步骤，通常不适合用作POCT。更重要的是，这些传统的检测方法缺乏在感染早期检测抗体的敏感性，也无法监测免疫功能低下患者中抗SARS-CoV-2抗体水平的变化。

近日，一组来自中国的研究团队在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“A CRISPR-based ultrasensitive assay detects attomolar concentrations of SARS-CoV-2 antibodies in clinical samples”的文章。在本文中，研究团队介绍了一种超灵敏的基于CRISPR的抗体检测（UCAD）方法，其灵敏度比商业ELISA试剂盒高10000倍，可以有效区分抗SARS-CoV-2和抗其他冠状病毒（如SARS-CoV和MERS-CoV）的抗体，还可以对野生型（WT）SARS-CoV-2、δ或奥密克戎突变体产生的抗体产生特异性反应。由于超高灵敏度，UCAD还允许检测免疫受损亚群中的抗SARS-CoV-2水平，其抗体水平被标准CLIA定义为“不可检测”。

图片来源：Nature Communications

主要内容

UCAD分析的设计和操作

UCAD的理念是将抗SARS-CoV-2的检测转化为预先设计的CRISPR-Cas12a可靶向双链DNA（dsDNA）barcode的产生，从而抗体可以激活Cas12a的重组酶聚合酶扩增（RPA）和单链DNA酶（ssDNase）活性（图a）。在没有抗体的情况下破坏Cas12a的结合和激活，在存在抗RBD的情况下，两个DNA探针空间上接近，从而形成稳定的双链（图c）。

UCAD的检测方案包括三个简单步骤，包括（1）抗体特异性的引物延伸以产生dsDNA条形码；（2） RPA扩增；和（3）由CRISPR-Cas12a介导的荧光团猝灭基团（FQ）标记的ssDNA报告物的切割。每个步骤的反应均在单个试管中在恒定37°C下进行，无需任何分离步骤。结果显示能够检测到低至10aM的抗RBD人单克隆抗体，其LOD与基于CRISPR的NAT的LOD相当（图f）。且对比实验表明UCAD测定比商用的ELISA测定方法至少敏感10000倍。

UCAD的设计原理和灵敏度。图片来源：Nature Communications

UCAD的特异性和模块性

UCAD也被确定为高度特异性，这通过在整个浓度范围内（图a）与针对MERS-CoV RBD和SARS-CoV-2 N人单克隆抗体以及针对SARS-CoV-2 RBD的兔多克隆抗体的低交叉反应性来证明。临床血清样本检测结果也同样证实了UCAD的低交叉反应性。

UCAD也是高度可调节的，其特异性可以通过简单地切换与TS探针连接的抗体识别结构域来工程化（图d）。分别用野生型（WT）SARS-CoV-2、δ突变体和奥密克戎突变体的RBD修饰TS探针，并验证针对三种SARS-CoV-2亚型产生的单克隆抗体的UCAD测定（图e），结果同样显示低交叉反应性。

UCAD的特异性和模块性。图片来源：Nature Communications

UCAD的临床验证

对四川大学华西医院之前使用标准全抗RBD-CLIA试验检测的65份阳性临床人类血清（女性：n=37，56.9%；男性：n=28，43.1%；年龄：45.5±17.1）和新冠肺炎爆发前2019年收集的77份大流行前血清进行了UCAD验证。阳性和大流行前队列之间存在显著差异（p<0.0001，n=142）（图d，e）。UCAD（n=197）的敏感性和特异性分别为100%和98.5%（图g）。总之，在总共132份大流行前和CLIA确认的阴性样本中，仅发现两份UCAD与CLIA不一致的样本。由于这两个样本都是在55个大流行后CLIA阴性血清的队列中发现的，因此有可能这两名参与者暴露于病毒，并产生低于CLIA LOD的低水平anti-RBD。

UCAD的临床验证。图片来源：Nature Communications

接种疫苗的KTR中anti-RBD IgG/IgM的检测

为了进一步证明UCAD检测免疫低下人群中低丰度抗体的临床潜力，研究团队研究了一组85名KTR，他们接受了2剂使用UCAD的新冠肺炎灭活疫苗（女性：n=24,28.2%；男性：n=61,71.8%；年龄：42.3±9.7，图a）。使用标准CLIA分析法，85个KTR中只有5个（5.9%）被发现为抗RBD阳性。相比之下，使用UCAD确定总共73个KTR（85.9%）为抗RBD阳性，包括54个IgG+和67个IgM+（图b-e）。对于抗RBD IgG和IgM，KTR队列的UCAD信号显著高于阴性对照组（n=217，p<0.0001）（图d，e）。正如预期的那样，在接种疫苗后，KTR中观察到体液免疫性显著降低，其证据是抗RBD IgG和IgM水平远低于接种健康队列的水平（n=150，P<0.0001）（图d，e）。

UCAD检测接种KTR的抗RBD IgG/IgM。图片来源：Nature Communications

将UCAD与测流检测技术进行整合

作为一种基于CRISPR的超灵敏检测方法，UCAD作为一种在资源有限的条件下检测抗SARS-CoV-2抗体的POCT，也具有很大的前景。研究团队通过在3′端和5′端分别用FAM和地高辛（Dig）标记，设计了UCAD的测流检测。使用测向流动方法测试UCAD，以检测临床血清中的anti-RBD IgG和IgM。与基于荧光的读数一致，研究团队能够清楚地识别出15种抗SARS CoV-2阳性临床血清（图c，d）。

将UCAD与测流检测进行整合。图片来源：Nature Communications

总结与讨论

在这项工作中，研究团队证明，UCAD检测抗SARS-CoV-2 RBD血清IgG和IgM的灵敏度是标准ELISA的10000倍。UCAD还具有高度可调节性，通过切换TS探针上的目标识别基序，允许敏感和特异地检测抗SARS-CoV-2 N蛋白和抗δ和奥密克戎RBD的抗体。UCAD的荧光读数可以很容易地转换为具有视觉读数的横向流动测试，这已使用临床血清成功验证。因此，UCAD在资源受限的条件下尤其有吸引力，包括：凭借超高灵敏度、模块化和简单性，我们预计UCAD将在冠状病毒、寨卡病毒、猴痘病毒等引起的新发传染病的早期诊断和监测中得到广泛应用。它也可用于检测与身体疾病（如癌症）严重相关的低丰度蛋白质基生物标志物。

总之，这项工作证明了UCAD作为一种超敏感蛋白分析的发展和临床应用，能够重新定义临床血清中“无法检测”的抗SARS-CoV-2抗体水平。在未来的研究中，我们旨在使用该方法跟踪感染者和接种者抗体水平的时间变化，以更好地了解健康人和免疫缺陷群体的免疫力。我们还将进一步设计UCAD作为一种广泛应用的POCT，用于超灵敏检测抗SARS-CoV-2以外的临床重要蛋白。