导读：

WB是蛋白研究中最常用的方法之一，但因为其步骤繁杂结果变幻莫测成为很多新手的梦魇。希望小伙伴们看完此文章，好好学习实验protocol资料，在蛋白研究中取得更加高效的成果。

1 简述

Western Blot（简称WB），蛋白质免疫印迹法，是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性，通过显色技术，以达到检测目的蛋白的技术。该技术广泛应用于定性检测蛋白水平的表达，活性分析与鉴定。该实验步骤多，关键点多，耗时长，每个步骤可能都影响最终的结果，所以实验中经常出现各种问题。本文对WB实验中常出现的各种问题进行归纳总结，并给出相应的解决方法，以便了解WB实验中的注意点和规范操作的必要性，同时对WB出现的问题分析和解决提供参考。

2 实验原理

WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

3 实验流程图

WB实验流程图

4 常见问题可能原因和解决办法

WB实验步骤较多，耗时均较长，且每步都影响最终的结果表现。我们将常见问题总结归纳为5大类，见下表。

章节	问题
4.1	无信号，没有阳性条带
4.2	有阳性条带，但条带信号弱
4.3	条带或位置异常（微笑条带；皱眉条带；条带变形；哑铃条带；条带位置异常；条带粘连）
4.4	高背景（均一性高背景；非均一性高背景）
4.5	非特异性条带多
4.6	其它问题（目标条带是空白，周围有背景；条带中间或周围出现白影；非均一性背景）

今天小编就给大家带来一份实验protocol,其中包含WB在内的几十种实验详细教程！

标书毕业论文都能用上

涵盖内容：

表达检测：高通量、核酸水平、蛋白质水平

正反回复 ：分子克隆、基因沉默敲除、基因突变、载体工具

实验模型：细胞模型、动物模型

表型验证：细胞增殖、糖酵解、纤维化等等

目录

部分截图：

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7个基因表达检测实验

包含7个基因表达检测详尽教程，如rtPCR、PCR引物设计、RNA抽提、RT-qPCR、WB实验、IHC实验、免疫组化图像分析。

每个实验都详细介绍了样品制备、操作要点、数据分析……

1rtPCR
rtPCR 技术可以分解为：RNA 抽提、反转录、PCR、PCR 产物检测。

2PCR 引物设计
PCR，相信我们都不陌生，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，使极少量的基因组DNA 或RNA样品中特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。

3RNA抽提

RNA抽提有很多种方法，其中TRIzol法是最流行的。

4RT-qPCR

以cDNA为模板进行PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

5WB实验

蛋白免疫印迹（Western Blotting）是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异 性抗体检测某特定蛋白的一种蛋白质检测技术。

6IHC实验
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组 织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。

7免疫组化图像分析
使用软件Image-Pro Plus 6（IPP6）分析单张免疫组化图像、多张免疫组化图像以及批量分析免疫组化图像，包括校正图片、选定测量项目、选定测量范围、测量、输出数据等详细步骤。

......

2

7个基因表达操作实验

1过表达

基因过表达操作流程为构建基因过表达载体——转染——检测过表达效果。

2融合基因表达

构建融合基因克隆的重点在引物设计，而引物设计要点在——不能移码！不能中间就终止！

3长片段/突变基因表达

长片段/突变基因克隆的重点在引物设计和 PCR。

4RNAi

RNAi 技术的重点在 siRNA 设计，siRNA 设计优先使用文献中或预设计siRNA库中已经验证过的siRNA靶点，实验时同时使用多个有效靶点以排除脱靶效应，既可以直接使用siRNA片段，也可以使用shRNA来进行RNA干扰。

5miRNA 靶序列寻找

microRNA（miRNA）是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子，它并不编码 蛋白质，因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编 码 RNA。

6miRNA QPCR 检测

在做qPCR的过程中，常常会出现各种问题，让初学者一筹莫展，要debug，首先要明白bug是怎么出现的，才能对症下药。

7流式检测细胞周期

PI法是经典的周期检测方法，PI为插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入 DNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

......

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读文献学实验

身边很多小伙伴刚开始读实验类文献的时候都是这样的：

1.读标题：这什么鬼，看不懂

2.读概述：emmm我好像大概应该明白了

3.拉到下面，扫了一眼：WOC怎么这么多图！这都是什么鬼？这个&*（…%是什么？这个#￥%@^又是什么?

4.还是其他文章更适合我

不知道屏幕前的你，是不是也是这样呢？

解螺旋精选了几篇文献，教大家如何通过阅读Results标题获取“故事大纲” ，快速了解文献中所用的实验方法。帮助大家完善和调整实验设计，通过实验过程进一步理解和领悟文献中的相关细节。

以上

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