撰文 | Qi

自噬是一种对细胞稳态和应激反应至关重要的降解途径，关键事件之一是吞噬泡的膜生成，但人们对于这一过程仍知之甚少。自噬体的形成依赖于特定的自噬相关 (ATG) 蛋白网络，其中 ATG9A 是唯一的跨膜蛋白，也是吞噬细胞膜中的脂质加扰酶，有助于平衡ATG2A 递送的脂质。尽管结构研究已经证明了ATG2A和ATG9A的直接相互作用【1】，但自噬的功能后果及其相互作用界面仍有待确定。

近日，英国弗朗西斯·克里克研究所的Sharon A. Tooze团队在Molecular Cell杂志上发表了一篇题为 ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation 的文章，他们通过将肽阵列、交联和氢氘交换质谱数据与低温电镜数据相结合，提出了ATG9A-2A复合物的分子模型。使用这种综合结构建模方法，他们确定了几个介导ATG9A-2A相互作用的界面，这些界面将允许脂质从ATG2A直接转移到ATG9A的脂质结合垂直分支中，突变分析与功能活性测定相结合证明了它们对自噬的重要性。

研究人员首先对内源性 ATG2A 与内源性 ATG9A进行coIP，使用纯化的蛋白质来证明 ATG9A-2A 的直接相互作用，并通过负染色透射电子显微镜 (NS-EM) 来表征复合物的3D构象，由于3D重建的分辨率较低，作者使用诱变结合肽阵列来绘制ATG9A-2A结合界面，并将ATG2A S2（残基1760–1779）视为潜在的 ATG9A 结合位点，该序列的删除会导致与ATG9A 的结合减少70%。随后，作者使用带有DSBU的CXL-MS（化学交联与质谱联用）的方法来映射ATG9A与ATG2A的接口，共鉴定了177个独特的交联，其中22个是ATG9A和ATG2A蛋白间交联，且假定结合位点位于ATG9核心域和C末端。通过构建截断体证明ATG9A的C末端可以调节ATG2A结合，但在交互界面中仅起次要作用。于是作者使用3xFlag-ATG2A 去探测ATG9A N端肽阵列，删除残基233–252，导致与ATG2A的结合减少约50%，支持主要结合位点在ATG9A的N端核心域。

为了验证消除ATG9A-2A的结合对自噬的影响，作者使用ATG2A/B CRISPR-Cas9 DKO细胞系【2】并稳转ATG2A WT或ATG2A ΔS2。自噬流可以被ATG2A WT而非后者挽救，但由于ATG2A ΔS2的脂质体束缚也减少且与较慢的脂质转移速率一致因而不能证明仅仅是由于ATG9A结合减少而造成无法挽救自噬流的后果。于是作者继续用CRISPR生成了ATG9A WT或ATG9A ΔC22 的稳定细胞系，细胞在饥饿状态下，只有WT而非ΔC22可以挽救自噬流。为了确认对自噬通量的影响是由于ATG2A结合的消除，作者纯化了ATG9A ΔC22并确认它保留了加扰酶活性。因此，这些结果表明ATG9A和ATG2A之间的相互作用是自噬流所必需的。

为了阐明完整的ATG9A-2A相互作用界面，作者使用了氢氘交换质谱 (HDX-MS)，相互作用的界面应该具有降低的溶剂可及性。简单来说，三个ATG9A区域显示出对氘交换的保护：220-240 (9A HDX S1)、363-373 (9A HDX S2)和437-454 (9A HDX S3)，保护峰值为3000秒，578-602 (9A HDX S4)仅在30秒时显示出显着的保护作用，表明相互作用更加动态，9A HDX S2的保护表明ATG2A结合降低了垂直分支的溶剂可及性。在这一ATG9A-2A模型中，ATG2A通过其CLR域与ATG9A的一个原体广泛接触，ATG2A 还与相邻的原体接触，假定的脂质转移腔的C端开口与CLR结构域连续，靠近膜和被认为参与脂质结合的 ATG9A 的垂直分支。总之，这项工作描述了在吞噬泡中起核心作用的ATG9A-2A蛋白复合物的分子细节，提供了对自噬体生物发生中复杂功能的机制见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.10.017

参考文献

1. Ghanbarpour, A., Valverde, D.P., Melia, T.J., and Reinisch, K.M. (2021). A model for a partnership of lipid transfer proteins and scramblases in membrane expansion and organelle biogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 118. 118.10.1073.

2. Valverde, D.P., Yu, S., Boggavarapu, V., Kumar, N., Lees, J.A., Walz, T., Reinisch, K.M., and Melia, T.J. (2019). ATG2 transports lipids to promote autophagosome biogenesis. J. Cell Biol. 218, 1787–1798.

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